Participación de las células NK en el control de la infección por EBV en pacientes pediátricos

• Autores: Ferressini Gerpe, Natalia Marina
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Chabay, Paola Andrea
• Materia: INFECCION POR EBV; PRIMOINFECCION; ASINTOMATICA; PACIENTES PEDIATRICOS; CELULAS NK; DESARROLLO DE CELULAS NK; INFECCION IN-VITRO; EBV INFECTION; PRIMARY INFECTION; ASYMPTOMATIC; PEDIATRIC PATIENTS; NK CELLS; NK CELLS DEVELOPMENT; IN-VITRO INFECTION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El virus de Epstein-Barr (EBV) es un miembro de la familia Herpesviridae que infecta, de forma latente y de por vida, al 90% de la población mundial. Su sitio de ingreso son las amígdalas, donde encuentra a sus células blanco, los linfocitos B. En países en vías de desarrollo la infección primaria ocurre mayoritariamente en la primera infancia de forma asintomática. Particularmente en Argentina, el 70% de los niños y niñas evaluados por nuestro grupo, presentaron serología positiva para EBV en los primeros 3 años de vida. El EBV posee potencial oncogénico dada la expresión de oncoproteínas mediante las cuales regula la supervivencia de los linfocitos B durante el establecimiento de la infección. Nuestro grupo de trabajo describió una asociación entre la presencia del EBV y el desarrollo de linfomas en pacientes pediátricos menores de 10 años. Las células NK cumplen funciones tanto antivirales como antitumorales, dada su capacidad de producir citoquinas como interferón gamma (IFNγ), y de reconocer células tumorales por el mecanismo conocido como respuesta missing-self. En pacientes pediátricos de países desarrollados se demostró que las células NK cumplen un rol fundamental en la infección primaria por EBV. Particularmente, se describió que la subpoblación caracterizada como CD56BrightCD94+, prevaleciente en pacientes pediátricos que se hallaban cursando la primoinfección, restringe la infección viral y la transformación mediada por EBV. El objetivo de este trabajo fue, por un lado, describirla infección por EBV en las amígdalas, sitio de ingreso y reactivación viral y, por otro lado, analizar las características de las células NK presentes en las amígdalas y su capacidad de controlar la infección por EBV in-vitro. Se analizó un total de 84 pacientes pediátricos de 1 a 15 años de edad (mediana 5 años), clasificados según su estatus serológico para EBV. Se determinó la carga viral mediante PCR en tiempo real y el tipo viral por PRC dirigida al gen codificante para la proteína EBNA3C. Mediante inmunohistoquímica para las proteínas virales LMP1, LMP2a, EBNA2 y BMRF1 e hibridización in- situ para los transcriptos virales EBERs, se determinó el perfil de latencia presente en cada paciente. Por inmunohistoquímica para CD56, IFNγ y Granzima B (GzB) se analizó de forma indirecta la presencia y actividad de las células NK en el tejido. Se caracterizaron por citometría de flujo los marcadores CD3, CD56 y CD16, CD94, NKG2D, CD34, CD57, c-kit (CD117) y CD69 y se evaluó la capacidad de las células NK de producir IFNγ luego de ser estimuladas. Se realizaron ensayos in-vitro para determinar la capacidad de las células NK de inhibir la infección por EBV y la producción de IFNγ en presencia del virus mediante ELISA. No se observaron diferencias en la edad ni en la carga viral entre los 4 grupos de pacientes. No hubo diferencias significativas en los perfiles de latencia entre grupos de pacientes, aunque el perfil LIII se presentó casi exclusivamente en portadores sanos. Se encontró un número significativamente mayor de casos positivos para BMRF1 en portadores sanos. El EBV tipo 1 prevaleció en la cohorte de pacientes. La infección por EBV-2 fue mayor en pacientes mayores de 10 años y sólo 3 pacientes presentaron coinfección. Por inmunohistoquímica se observó una correlación positiva entre CD56 e IFNγ particularmente en pacientes primoinfectados y un aumento en el número de células positivas para GzB en pacientes no infectados. Los pacientes infectados presentaron un mayor porcentaje de células CD56Bright respecto de los no infectados. No se observó un aumento significativo en ninguna de las subpoblaciones de CD56Bright ni en la producción de IFNγ en pacientes primoinfectados. Por el contrario, la producción de IFNγ fue mayor en pacientes no infectados. En línea con estos hallazgos, los ensayos in-vitro no arrojaron diferencias significativas en los números de células infectadas por EBV en presencia o ausencia de NK, mientras que el IFNγ producido fue, en casi todos los casos, menor al límite de detección del ELISA. La presencia de subpoblaciones de CD56Bright caracterizadas por una baja expresión de CD94, junto con la expresión de marcadores de inmadurez como CD34 y baja expresión de CD57, con una producción poco eficiente de IFNγ tanto en los pacientes como frente a células infectadas por EBV in-vitro, podrían estar asociadas a defectos en el control de la infección por EBV.
Epstein-Barr virus is a member of the Herpesviridae family that infects, latently and for the host life, 90% of the population worldwide. Its site of entry is de tonsils where it infects the target cells, the B cells. In developing countries, the primary infection occurs mostly in childhood and is usually asymptomatic. Particularly in Argentina, 70% of the children evaluated by our group, presented positive serology for EBV in the first 3 years of life. EBV has oncologic potential given the expression of oncoproteins which regulates the survival of the B cells during the infection establishment. Our group has described an association between the presence of EBV and different types of lymphoma development in patients under 10 years of age. NK cells have both antiviral and antitumoral roles, thanks to their capacity to produce cytokines such as gamma interferon (IFNγ), and the capacity to recognize tumor cells through the “missing self” mechanism. In pediatric patients from developed countries, it was demonstrated that NK cells play a key role in the control of EBV infection. Particularly, it was reported that the CD56BrightCD94+ population, predominant in pediatric patients undergoing primary infection, restricts both viral infection and EBV-mediated transformation. The aim of this work was, in one hand, to characterize EBV infection in tonsils, the site of viral entry and reactivation and, on the other, to analyze the characteristics of the NK cells present in the tissue and its capacity to control EBV infection in-vitro. A total of 84 patients between 1 and 15 years of age (median 5 years) were analyzed, classified according to their serological status for EBV infection. Viral load was determined by real time PCR and viral type was assessed by PCR directed against the gene coding for EBNA3C protein. Immunohistochemistry (IHC) was performed to assess the presence of viral proteins LMP1, LMP2a, EBNA2 and BMRF1 and in-situ hybridization was performed to detect viral transcripts EBERs, with this data the latency profile expressed in each patient was determined. CD56, IFNγ and Granzime B (GzB) were detected by IHC to indirectly determine the presence and activity of NK cells in the tissue. Flow Cytometry was performed to analyze the expression of CD3, CD56 y CD16, CD94, NKG2D, CD34, CD57, c-kit (CD117) y CD69 and to determine the capacity of NK cells to produce IFNγ after being stimulated. In-vitro assay was performed in order to determine the capacity of NK cells to restrict EBV infection and ELISA was used to measure the IFNγ produced by NK cells during the assay. There were no differences neither in age nor in viral load between the 4 groups of patients. No differences were observed in the latency profile when the groups of patients were compared, although LIII profiles was almost exclusively present in healthy carriers. BMRF1 positive cells were found mostly in healthy carriers. EBV type 1 prevailed in the entire cohort of patients. EBV type 2 infection was higher in patients of 10 years or older and only 3 patients were co-infected. When IHC results were analyzed, a positive correlation between CD56 e IFNγ was found, particularly in primary infected patients, also, a high number of GzB positive cells were found in non-infected patients. Infected patients presented a higher percentage of CD56Bright cells compared with non-infected patients. No significant increase of any CD56Bright subpopulation or IFNγ production was observed in the primary infected group. On the contrary, IFNγ production was higher in non-infected patients. In-vitro assays showed no differences in the number of infected cells regardless the presence or absence of NK cells. IFNγ levels assessed by ELISA were lower than the detection limits in almost all cases. The presence of CD56Bright subpopulations characterized by low CD94 expression, together with a high expression of immaturity features such as high percentage of CD34 and low expression of CD57, together with the inefficient IFNγ production in patients as well as against EBV-infection in-vitro, might be associated with defects in the control of EBV infection.
Fil: Ferressini Gerpe, Natalia Marina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.