Aplicaciones de FLIM-FRET y de microscopía de fuorescencia 3D en inmunohematología

• Autores: Riquelme, Bibiana Doris; Isla, Natalia G. de; Dumas, Dominique; Valverde de Rasia, Juana Rosa
• Año de publicación: 2005
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: artículo
• Fuente: An. (Asoc. Fís. Argent., En línea) 2005;01(17):115-118
• Materia: CONFOCAL; MULTIFOTON; FLIM; FRET; GLOBULOS ROJOS; GLICOFORINA; CITOESQUELETO; CONFOCAL; MULTIPHOTON; FLIM; FRET; RED BLOOD CELL; GLYCOPHORIN; CYTOSKELETON
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Mediante la técnica de FRET se caracterizó la aglutinación de glóbulos rojos (GR) usando fluoróforos localizados en la membrana celular (DiI) y fluoróforos (Alexa488TM) combinados por marcado secundario con anticuerpos monoclonales anti-Glicoforina A, B y C (GPA, GPB y GPC). El análisis por FLIM fue utilizado para discriminar la señal de FRET de las moléculas cuando había superposición de su emisión espectral. Se extrajeron los lípidos de la membrana de GR con Triton X-100 y se analizaron las interacciones GP-citoesqueleto por microscopía de fluorescencia 3D. Dada las propiedades fluorescentes en los GR del par Alexa488TM (donor) y DiI (aceptor), se espera observar un FRET efectivo cuando hay aglutinación de GR. FLIM en estado dinámico permite evaluar el mecanismo subyacente del proceso de transferencia de energía en los GR aglutinados. Los resultados demuestran que para excitación a 780nm, sólo se observa FLIM-FRET desde el fluoróforo Alexa488TM al DiI para los anti-GPB, con una distribución de tiempo de vida en el rango de los picosegundos, no observándose un FRET efectivo para los anti-GPA. La microscopía de imágenes fluorescentes 3D mostró interacciones tanto entre el citoesqueleto con las GPC como con las GPB pero no con las GPA. Estos resultados revelados sólo por estas técnicas, comprueban la importancia de la reactividad específica de los anticuerpos monoclonales utilizados con las Glicoforinas A, B o C
FRET technique has been developed to characterize the red blood cell (RBC) agglutination based on the interaction of fluorophores (Alexa488TM, DiI) located in the RBC membrane or combined to secondary antibody directed against the anti glycophorins A, B and C monoclonal antibodies. Combined intensity (spectral) and Lifetime (FLIM) Imaging was used to discriminate the FRET signal of molecules on their different lifetimes whereas their emission spectral overlap. Furthermore, GP-cytoskeleton interactions were analyzed by 3D-fluorescence microscopy after lipid extraction with Triton X-100 in red cell. In view of the fluorescence properties depicted in RBC for the pair of fluorophore Alexa-488TM (donor) and DiI (acceptor), it may be expected that upon agglutination of RBC, effective FRET should be observed. FLIM in dynamic-state provides a discrimination of molecules in their fluorescence lifetime, which allows evaluating the underlying mechanism of energy transfer process in the agglutinated erythrocytes. The results demonstrate that’s upon excitation at 780 nm the FLIM-FRET from Alexa488TM to DiI for the anti-GPB monoclonal antibodies only with a lifetime distribution in the picosecond range. 3D-fluorescence microscopy images showed interactions between GPC or GPB and cytoskeleton and did not show interactions between GPA and cytoskeleton. All together, these results only revealed by FRET-FLIM and 3D-fluorescence microscopy strongly support the importance of the specific reactivity with Glycophorin A B or C
Fil: Riquelme, Bibiana Doris. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR-FBIOyF). Santa Fe. Argentina
Fil: Isla, Natalia G. de. Unidad Mixta de Investigación. Ingénierie cellulaire et tissulaire (UMR CNRS). Nancy. Francia
Fil: Dumas, Dominique. Unidad Mixta de Investigación. Ingénierie cellulaire et tissulaire (UMR CNRS). Nancy. Francia
Fil: Valverde de Rasia, Juana Rosa. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas (UNR-FBIOyF). Santa Fe. Argentina