Caracterización cinética de la Na,K-ATPasa aislada de riñón de goldfish (Carassius auratus)

• Autores: García, Mariela Paula
• Año de publicación: 1999
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de grado
• Colaborador/a o director/a de tesis: Schwarzbaum, Pablo J.
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La bomba de sodio (Na,K-ATPasa) cataliza el intercambio de Na+ intracelular por K+ extracelular utilizando la energía liberada por la hidrólisis de ATP en ADP y fosfato inorgánico. El modelo cinético corrientemente aceptado postula la formación y desaparición de intermediarios fosforilados (EP), y transiciones conformacionales tanto en estos como en los intermediarios desfosforilados. En este trabajo se estudió el ciclo de reacción de la Na,K-ATPasa de riñón de goldfish a través de la cuantificación de EP. En particular se estudió el ciclado de la enzima en presencia de concentraciones de ATP del orden de nano a micromolar. Los resultados se contrastaron con una serie de modelos simplificados que incluyen los pasos básicos del modelo cinético vigente para la Na,K-ATPasa. Resultados experimentales: Por un lado se realizaron experimentos donde: 1. la enzima se sometía a fosforilación por ATP (cinética de fosforilación) y 2. la enzima fosforilada en estado estacionario se sometía a desfosforilación (cinética de desfosforilación). Por otro lado EP fue medido como función de la concentración de ATP luego de que la enzima ciclara suficiente tiempo como para alcanzarse el estado estacionario. Cinética de fosforilación: para cada concentración de ATP empleada, EP fue función exponencial creciente del tiempo. La constante aparente de fosforilación aumentó con la concentración de ATP, obteniéndose un valor asintótico máximo de 7 s-1. Cinética de desfosforilación: la desfosforilación de EP fue bifásica. En presencia de K+ los valores de las constantes fueron 1 s-1 (fase rápida) y 0.1 s-1(fase lenta), mientras que en ausencia de K+ fueron 0.07 s-1 (fase rápida) y 0.003 s-1(fase lenta). Experimentos en estado estacionario: se midió el nivel estacionario de EP (EPEE)como función de [ATP]. En presencia de K+ el mejor ajuste a los datos se obtuvo con una hipérbola más una recta, de la cual resultó un valor de KmIEP 0.05 ± 0.04 μM (n = 3). Por otro lado en ausencia de K+ el nivel de EP EE fue función hiperbólica de la concentración de ATP (0.01 —10μM) con KmEP= 0.06 ± 0.03 uM (n = 3). A modo de comparación se repitió este experimento utilizando la Na, K-ATPasa de microsomas renales de trucha y de cerdo. En todos los casos se obtuvo una cinética hiperbólica para EP en función de la concentración de ATP, con valores de KmEP de 0.05 ± 0.03 μM (n = 3) para micromas de trucha y 0.07 ± 0.03 μM (n = 3) para microsomas de cerdo. Resultados teóricos: Los valores de las constantes aparentes de fosforilación y desfosforilación fueron utilizados para estimar los valores de las constantes parciales k2, k4 y k40 del ciclo de reacción de la enzima. Estos valores fueron luego introducidos en modelos teóricos que simulaban el comportamiento dinámico de la enzima en presencia de K+ (Na,K-ATPasa) o en ausencia del catión (Na-ATPasa). Posteriormente se procedió a someter estos valores a un proceso de ajuste a los datos experimentales, con lo cual se obtuvo un grupo de parámetros que minimizaban la función error en todos los casos (para experimentos en estado pre-estacionario y en estado estacionario) y que al mismo tiempo eran compatibles con los modelos cinéticos empleados. Estos valores fueron: k2 = 10.7 s-1, k40= 0.17 s-1 y k4 = 0.44 s-1. La evidencia experimental es compatible con el modelo cinético vigente, y permite afirmar que los pasos esenciales del ciclo de reacción de la enzima se cumplen para la Na,K-ATPasa de riñón de goldfish. A partir de esto y de la comparación de los valores de KmEP obtenidos para goldfish, trucha y cerdo se deduce que el patrón cinético está altamente conservado en los vertebrados. De estudios anteriores se sabía que la función de la Na,K-ATPasa en distintos tipos celulares de goldfish presentaba características únicas que le permitían a esas células sobrevivir bajo fuerte inhibición metabólica, situación en la cual la concentración de ATP en la vecindad de la bomba está en el orden nano a micromolar. Los resultados de este trabajo muestran que esas características no pueden ser debidas a una mayor afinidad del ATP por la enzima.
Fil: García, Mariela Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.