Caracterización físico-química de la membrana de Bacillus subtilis frente al estrés osmótico : relevancia de los fosfolípidos aniónicos en la osmorrespuesta

• Autores: López, Claudia Susana
• Año de publicación: 2002
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Rivas, Emilio A.
• Materia: BACILLUS SUBTILIS; ESTRES OSMOTICO; LIPIDOS ANIONICOS; MICROVISCOSIDAD DE LA MEMBRANA; CARDIOLIPINA; BACILLUS SUBTILIS; OSMOTIC STRESS; ANIONIC LIPIDS; MEMBRANE MICROVISCOSITY; CARDIOLIPIN
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La respuesta de las bacterias al estrés osmótico es actualmente de gran interés debido alos aspectos importantes de su aplicación. La mayoría de los estudios realizados enprocariotas se han focalizado sobre la regulación genética y sobre aspectos fisiológicos de laadaptación a la alta osmolaridad. El comportamiento de las envolturas no ha sidoprácticamente estudiado, sin embargo, existen diversas evidencias que sugieren que lacomposición de las envolturas celulares posee un rol importante durante el mecanismo deosmosensado. El objetivo de este trabajo fire el de estudiar el efecto del estrés osmótico sobrela estructura y composición bioquímica y biofisica de las membranas de Bacillus subtilis YB886 utilizando diferentes enfoques como la bioquímica, espectroscopía de fluorescencia ybiología molecular. En esta tesis demostramos que se producen importantes variaciones en la composiciónde lípidos polares y de ácidos grasos (AG) durante la adaptación de B. subtilis. Entre losprincipales fosfolípidos presentes en la membrana de esta especie, se observó que cuando labacteria es crecida en medios hipersalinos se produce una disminución en el contenido defosfatidilglicerol de 40 a 31% y un aumento en el de cardiolipina de 24 a 46%. Además delas variaciones observadas a nivel del grupo polar de los lípidos, se determinó un cambiosignificativo en la composición de AG entre las diferentes condiciones de cultivo. Lascélulas crecidas en el medio hipersalino presentan una marcada disminución en el contenidode AG saturados ramificados y un aumento en el de los saturados lineales. Asimismo, seobservó un aumento en el contenido de los AG monoinsaturados, los cuales representan un 6% bajo condiciones normales de crecimiento y alcanzan un 18% en estrés osmótico. Con el objetivo de caracterizar la estructura y dinámica de la membrana, se utilizarondiferentes técnicas espectroscópicas. Se determinó que en respuesta al estrés osmótico seproduce un aumento en el empaquetamiento de los lípidos de las membranas, hecho que fueevidenciado por medio de las tres sondas fluorescentes utilizadas. No obstante, esta variaciónno se observó en los liposomas preparados con los lípidos extraídos a partir de las células,indicando que el aumento en el empaquetamiento de los lípidos depende de la presencia delas proteínas de membrana. En este trabajo también se determinó que en las membranas de B.subtilis otras propiedades fisicas de la membrana, como la hidratación de la interfaz, cambiaen fimción de la osmolaridad del medio exterior. Además, se construyeron diversas cepas mutantes para la biosíntesis de fosfolípidos. Los resultados obtenidos demostraron la importancia de los lípidos aniónicos (cardiolipina yfosfatidilglicerol específicamente) en la adaptación al estrés osmótico en esta especie. Nuestros resultados indican que la interrupción del gen cls2 provoca una deficiencia total enla síntesis de cardiolipina, sugieriendo que el producto del gen cls2 es la principalcardiolipina síntasa en esta especie. En esta tesis se demostró por primera vez los cambios biofisícos y bioquímicos que seproducen en la membrana de B. subtilis en respuesta al estrés osmótico. Estos cambios serianindispensables para contrarrestar el desbalance osmótico presente entre las células y el medioexterno.
Bacterial response to osmotic stress is of current and increasing interest due to theimportant aspects of its applications. Most of the studies on prokaryotes have centered ongenetic regulation and physiological aspects of their adaptation to high osmolarity. Thebehavior of the envelopes has been practically unexplored; nevertheless, several evidencessuggest that the cell envelope composition plays an important role during the osmosensingmechanism. The aim of the present work was to study the effect of osmotic stress on thebiochemical and biophysical parameters of structure and composition of the Bacillussubtilis YB886 membrane using different approaches such as biochemistry, fluorescencespectroscopy and molecular biology. In this thesis we demonstrated that there are important variations in membrane polarlipid composition and fatty acids (FA) during osmoadaptation in B. subtilis. Among themajor phospholipids present in the B. subtilis membrane, a decrease inphosphatidylglycerol content from 40 to 31%, and an increase in cardiolipin content from 24 to 46% were observed when the bacteria were grown in hypsaline medium. In additionto the variations observed at the polar group level, the FA composition, in particular,showed a significant change between different growth conditions. Bacterial growth inhypertonic medium resulted in a remarkable decrease in the branched-chain saturated FAcontent, and an increase in straight-chain saturated FA. There was also a significantincrease of unsaturated FA, which represented 6% in normal conditions and reached 18%during osmotic stress. In order to characterize membrane structure and dynamics, different spectroscopictechniques were used. Bacteria growth in hyperosmotic media evoked an increase in thelipid packing in isolated whole membranes, fact that was evidenced by the threefluorescent probes used. However, this effect was not observed in liposomes preparedwith the extracted bacterial lipids indicating that it was strongly dependent on thepresence of membrane proteins. In this work we also indicate that in B. subtilismembranes, other physical properties as interface hydration change as a function of theexternal medium osmolarity. In addition, several mutants for phospholipids biosynthesis were constructed. Wedemonstrated the importance of anionic lipids (cardiolipin and phosphatidylglyerolspecifically) for the adaptation of this specie to osmotic stress. Our results indicated thatthe interruption in gene cls2 resulted in a complete deficiency in cardiolipin synthesis,suggesting that B. subtilis cls2 gene product to be the major cardiolipin synthase. In our knowledge this is the first report about the biophysical and biochemicaladaptation of the B. subtilis membranes to osmotic stress. These changes would beindispensable to counteract the osmotic imbalance between the cells and the externalmedium.
Fil: López, Claudia Susana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.