Ingeniería de anticuerpos aplicada a la generación de nuevas entidades terapéuticas antagonistas de la actividad biológica de interferón-α2b humano

• Autores: Aguilar, María Fernanda
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Oggero, Marcos Rafael; Delfino, José María; Fossati, Carlos Alberto; Estrin, Darío Ariel; Attallah, Carolina Verónica
• Materia: Humanization; Antibody fragments; Molecular modelling and dynamics; Neutralizing activity; Fc N-glycosylation; Producer cell line; Humanización; Fragmentos de anticuerpo; Modelado y dinámica molecular; Actividad neutralizante; N-glicosilación del Fc; Línea celular productora
• Institución: Universidad Nacional del Litoral

Fil: Aguilar, María Fernanda. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina.
Con el objetivo de desarrollar moléculas terapéuticas capaces de neutralizar la actividad biológica (AB) del interferón alfa humano (hIFN-α), se llevó a cabo la humanización del fragmento murino scFv derivado del mAb CA5E6. El estudio comparativo de los modelos 3D de los scFv murino (mu.scFv) y humanizado (hz.scFv) reveló diferencias estructurales y dinámicas, mientras que el estudio in vitro de la interacción con el antígeno demostró una disminución en la fuerza de unión del hz.scFv. Adicionalmente, se llevaron adelante ensayos de docking guiado. Los resultados demostraron que, a pesar de que ambos scFv reconocen el mismo área en el hIFN-α, unen epitopes diferentes. Las evidencias obtenidas confirmaron que la humanización afectó la afinidad y especificidad del hz.scFv por la unión a su antígeno. Por otra parte, se obtuvo la molécula humanizada hz.scFv-Fc, que fue expresada en las líneas celulares CHO-K1 y HEK293. La caracterización funcional demostró que fragmento expresado en células HEK293 presentó una disminución notable de la afinidad y la capacidad neutralizante in vitro de la AB del interferón, comparándolo con el producido en células CHO. Sumado a esto, estudios con las mismas moléculas deglicosiladas mostraron que el grado de glicosilación del Fc influye sobre la capacidad neutralizante de estos fragmentos. Este trabajo destaca la importancia de la N-glicosilación del Fc y de la línea celular productora en el desarrollo de fragmentos de anticuerpos recombinantes. Finalmente, la evaluación preliminar de la inmunogenicidad ex vivo, demostró que la humanización reduciría, aún más, el bajo potencial inmunogénico de estos fragmentos.
In order to develop therapeutic molecules capable of neutralizing the biological activity (BA) of human interferon alpha (hIFN-α), the humanization of the murine scFv fragment derived from mAb CA5E6 was carried out. The comparative study of the 3D models of the murine (mu.scFv) and humanized (hz.scFv) scFv revealed structural and dynamic differences, while the in vitro study of the antigen-binding showed a decrease in the binding strength of hz.scFv. Additionally, guided docking assays were carried out. The results demonstrated that, despite the fact that both scFv recognize the same area in hIFN-α, they bind different epitopes. All these evidences confirmed that humanization affected the affinity and antigen-binding specificity of this hz.scFv. On the other hand, the humanized molecule hz.scFv-Fc was obtained, which was expressed in the CHO-K1 and HEK293 cell lines. The functional characterization showed that the fragment expressed in HEK293 cells showed a notable decrease in the affinity and in vitro neutralizing capacity of interferon BA, compared to that produced in CHO cells. Added to this, studies with the same deglycosylated molecules showed that the degree of glycosylation of Fc influences the neutralizing capacity of these fragments. This work highlights the importance of Fc N-glycosylation and the producer cell line in the development of recombinant antibody fragments. Finally, the preliminary evaluation of ex vivo immunogenicity showed that humanization would further reduce the low immunogenic potential of these fragments.
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
Universidad Nacional del Litoral