Rol de ligandos de segunda y tercera esfera de coordinación del sitio activo de cobre en las propiedades redox y catalíticas de la nitrito reductasa de Sinorhizobium meliloti 2011...

• Autores: Guevara Cuasapud, Lorieth Alejandra
• Año de publicación: 2025
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Brondino, Carlos Dante; Galassi, Vanesa Viviana; Santos, Javier; Signorella, Sandra Rosanna; Rivas, María Gabriela
• Materia: Nitrito reductasa; Sitio activo; Espectroscopía UV-vis y de EPR; Potencial de reducción; Nitrite reductase; Active site; UV-vis and EPR spectroscopy; Reduction potential
• Institución: Universidad Nacional del Litoral

Fil: Guevara Cuasapud, Lorieth Alejandra. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina.
La nitrito reductasa de Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK) cataliza la reducción de nitrito a óxido nítrico en la vía de la desnitrificación. Esta enzima es un homotrímero de ~40 kDa por subunidad con dos centros de cobre: T1 sitio de transferencia electrónica (TE) y T2 sitio catalítico. El correcto funcionamiento de estos centros depende no solo de sus ligandos directos, sino también de residuos ubicados en esferas externas de coordinación. El objetivo de esta tesis fue analizar el rol estructural y funcional del Asp134 (AspCAT) y Lys305, segunda y tercer esfera de coordinación de T2, respectivamente. Se obtuvieron variantes mediante mutagénesis sitio-dirigida: D134S y K305M. Ambas proteínas fueron producidas y purificadas en forma soluble y activa, aunque K305M presentó bajo rendimiento. Los estudios espectroscópicos (UV-vis, EPR), cinéticos, potenciométricos y cálculos computacionales (QM/MM) demostraron que D134S mantiene la estructura de SmNirK, pero presenta alteraciones en las propiedades electrónicas del T2 y una disminución significativa en la actividad catalítica a pH ácido. Los resultados indican que AspCAT no solo contribuye a la fijación de nitrito y transporte de protones, sino que también modula los potenciales de reducción y la eficiencia de TE entre T1 y T2. En contraste, K305M mostró baja estabilidad estructural, coexistencia de dímeros y monómeros en solución y alteraciones en T1, que sugieren que Lys305 desempeña un rol estructural. En conclusión, los residuos de segunda y tercera esfera de coordinación influyen decisivamente en la estabilidad y actividad de SmNirK, aportando evidencia fundamental sobre la relación estructura-función en enzimas desnitrificantes.
The nitrite reductase from Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK) catalyzes the reduction of nitrite to nitric oxide in the denitrification pathway. This enzyme is a homotrimer of ~40 kDa per subunit with two copper centers: T1, the electron transfer (ET) site, and T2, the catalytic site. The proper functioning of these centers depends not only on their direct ligands but also on residues located in outer coordination spheres. The aim of this thesis was to analyze the structural and functional roles of Asp134 (AspCAT) and Lys305, located in the second and third coordination spheres of T2, respectively. Variants were obtained by site-directed mutagenesis: D134S and K305M. Both proteins were produced and purified in soluble and active form, although K305M showed low yield. Spectroscopic (UV-vis, EPR), kinetic, potentiometric, and computational (QM/MM) studies demonstrated that D134S retains the overall structure of SmNirK but displays alterations in the electronic properties of T2 and a significant decrease in catalytic activity at acidic pH. The results indicate that AspCAT not only contributes to nitrite binding and proton transfer but also modulates the reduction potentials and ET efficiency between T1 and T2. In contrast, K305M showed low structural stability, coexistence of dimers and monomers in solution, and modifications in T1, suggesting that Lys305 plays a structural role. In conclusion, residues from the second and third coordination spheres decisively influence the stability and activity of SmNirK, providing fundamental evidence of the structure–function relationship in denitrifying enzymes.
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