Propiedades magnéticas y transferencia electrónica en la nitrito reductasa de cobre de Ensifer meliloti y su relación con la catálisis enzimática

• Autores: Duré, Andrea Belén
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Brondino, Carlos Dante; Daier, Verónica; Figueroa, Carlos María; Rasia, Rodolfo Maximiliano; González, Pablo Javier
• Materia: Nitrito reductasa; Cobre; Sitio activo; Potencial de reducción; Espectroscopía UV-vis y de EPR; Nitrite reductase; Copper; Active site; Reduction potential; UV-vis and EPR spectroscopy
• Institución: Universidad Nacional del Litoral

Fil: Duré Andrea Belén. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina.
La nitrito reductasa de Sinorhizobium meliloti (SmNirK) cataliza la reducción de nitrito a óxido nítrico en el ciclo del nitrógeno. SmNirK presenta estructura homotrimérica con dos sitios de cobre por subunidad denominados T1Cu y T2Cu que funcionan como sitio de transferencia electrónica (TE) y sitio activo, respectivamente. Una de las histidinas coordinadas a T2Cu que pertenece a la subunidad adyacente (H342) es de relevancia en la estabilidad estructural y funcional de la proteína, mientras que un glutámico (E315) de la segunda esfera de coordinación de T2Cu influye en el potencial de reducción del sitio. El objetivo de esta tesis fue estudiar los roles estructurales y funcionales de los residuos H342 y E315. Se obtuvieron variantes de SmNirK, reemplazando H342 por glicina (H342G) y E315 por alanina (E315A). Estudios cinéticos muestran que la afinidad por el sustrato se ve afectada en ambas variantes, mientras que la actividad especifica solo disminuye en H342G. Mediante EPR se evidenció en E315A una modificación en los potenciales de reducción de los sitios de cobre que favorece la TE. La caracterización molecular, espectroscópica (EPR y UV-vis) y cálculos computacionales (QM/MM) confirmaron que la vía de TE y la geometría de coordinación de T1Cu no se ven afectadas en las variantes. EPR y QM/MM mostraron que la geometría de coordinación del T2Cu solo se encuentra afectada en H342G. H342 representa un componente estructural esencial para un T2Cu con estructura y geometría adecuadas para la catálisis mientras que E315 presenta un rol relevante en el potencial de T2Cu.
Nitrite reductase from Sinorhizobium meliloti (SmNirK) catalyzes the reduction of nitrite to nitric oxide in the nitrogen cycle. SmNirK has a homotrimeric structure with two copper sites per subunit called T1Cu and T2Cu, which act as electron transfer (ET) and active site, respectively. One of the histidines of the neighboring subunit (H342) coordinated to T2Cu is important for the structural and functional stability of the protein, while a glutamine (E315) from the second coordination sphere of T2Cu influences the reduction potential of the site. The aim of this thesis was to investigate the structural and functional roles of residues H342 and E315. SmNirK variants were obtained in which H342 was replaced by glycine (H342G) and E315 by alanine (E315A). Kinetic studies show that the substrate affinity is affected in both variants, while the specific activity is only decreased in H342G. A change in the reduction potentials of the copper sites in favor of TE in E315A was detected by EPR. Molecular characterization, spectroscopic (EPR and UV-vis) and computational calculations (QM/MM) confirmed that the TE pathway and the coordination geometry of T1Cu are not affected in the variants. EPR and QM/MM showed that the coordination geometry of T2Cu is only affected in H342G. H342 represents an essential structural component for a T2Cu with a structure and geometry suitable for catalysis, while E315 plays an important role for the T2Cu potential.
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