Estudio mecánico-calorimétrico de la participación mitocondrial en la isquemia-reperfusión miocárdica de rata y cobayo y farmacodinamia de intervenciones cardioprotectoras

• Autores: Ragone, María Inés
• Año de publicación: 2011
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Consolini, Alicia Elvira
• Materia: Ciencias Exactas; calorimetría; cardioplegia; isquemia-reperfusión
• Institución: Universidad Nacional de La Plata

Esta tesis estudia los mecanismos subyacentes a un modelo de isquemia-reperfusión (I/R) en corazones enteros de rata y cobayo. Este modelo de isquemia global es reversible y genera un "corazón atontado o aturdido" durante la reperfusión. La disfunción (contractura diastólica y disminución de la fuerza desarrollada durante la contracción) está acompañada por una elevada liberación de calor que conduce a la disminución de la economía total muscular. Esto manifiesta una alteración en la regulación de la [Ca2+]i, que en principio refleja alteraciones en los mecanismos de remoción y liberación de Ca2+ al citosol, como las Ca2+-ATPasas del retículo sarcoplásmico (RS) y sarcolema (SL), el intercambiador Na+/Ca2+ sarcolemal (NXCSL) y los mecanismos mitocondriales. Dado que la regulación de la homeostasis de Ca2+ es un proceso dependiente de varios mecanismos, las características de la disfunción dependen de muchas variales, tales como el grado de daño durante la I/R, el grado de participación de cada organela en el ajuste del Ca2+ citosólico, que a su vez depende de la especie animal en estudio, y los tratamientos que modifican a los niveles iónicos o a los transportadores. Las mitocondrias proveen energía para la contracción muscular y el mantenimiento de gradientes iónicos. Además, poseen varios transportadores tales como: el uniporter de Ca2+ (UCam), el intercambiador Na+/Ca2+ mitocondrial (NXCm), los mKATP y el poro de transición de permeabilidad (mPTP) que influyen en los movimientos de Ca2+ de la célula y le confieren alta capacidad para la regulación de la [Ca2+]i en miocitos cardíacos. Durante la I/R varios mecanismos aumentan la [Ca2+]i y [Na+]i por lo que estos cambios, sumados a la deficiencia de oxígeno, contribuyen a afectar la actividad de los transportadores de Ca2+ mitocondriales y su función en la homeostasis celular de Ca2+. Un modo frecuente de proteger a los corazones frente a la isquemia provocada en una intervención quirúrgica cardíaca, además de detener su actividad marcapaso, es mediante las soluciones cardiopléjicas. Estas protegen al corazón de la injuria por isquemia y reperfusión previniendo la contractura diastólica y mejorando la recuperación de la contractilidad luego de la isquemia inducida y la recuperación. El objetivo general de esta tesis fue evaluar la participación de los mecanismos mitocondriales en la respuesta mecánico-calorimétrica de corazones aislados de rata y de cobayo pre-tratados con solución cardiopléjica de alta [K+]e-baja [Ca2+]e (CPG) y sometidos a I/R, utilizando herramientas farmacológicas para afectar en forma relativamente selectiva a los transportadores celulares. Este enfoque posibilita el análisis de los transportadores "in situ", permitiendo una interacción fisiológica entre los mismos para regular el Ca2+ citosólico y la funcionalidad mecánico-energética. Para ello se midieron simultáneamente la presión intraventricular izquierda (LVP en mmHg) y el flujo de calor total (Ht en mW/g tejido) de corazones enteros de rata y cobayo introducidos en la cámara interna de un calorímetro de flujo, en forma continua tanto en perfusión como en isquemia. Los corazones estabilizados dentro del sistema calorímetro fueron expuestos a diversos protocolos, sin y con un pretratamiento con solución de CPG en presencia o ausencia de algún inhibidor selectivo de los transportadores mitocondriales. El pretratamiento respectivo fue seguido de una isquemia por corte de flujo de 45 minutos en corazones de rata y de 30 minutos en corazones de cobayo para luego ser reperfundidos durante 45 minutos con solución Krebs control. Se trabajó a 30 ˚C de temperatura constante en el baño que rodea al calorímetro. En los corazones aislados de rata se estudió mecánico-calorimétricamente el rol del intercambiador Na+/Ca2+ mitocondrial (NXCm), pre-tratando a los corazones cardiopléjicos con clonazepam (Clzp, inhibidor especifico del mNXC). El Clzp en CPG redujo la recuperación contráctil post-isquémica (RCPI) y elevó el Ht sin afectar la prevención de la contractura diastólica en I/R. Se evaluaron las consecuencias en el reservorio y función del RS, reperfundiendo los corazones con Krebs+cafeína 10 mM-36 mM Na+ (para liberar el Ca2+ del RS sin eflujo de Ca2+ por el NXCSL). Clzp redujo el rLVP e incrementó el Ht durante la contractura inducida por cafeína, en una magnitud equivalente a un flujo de Ca2+ compatible con los flujos de Ca2+ mitocondriales descriptos en bibliografía con otras metodologías. Así, los resultados del bloqueo de NXCm sugirieron que la CPG activa el eflujo de Ca2+ mitocondrial vía el NXCm y contribuye a la carga del RS y a la RCPI. En otros protocolos, los corazones de rata fueron pretratados con CPG y 5-hidroxidecanoato (5-HD, bloqueante selectivo de los mKATP) sin y con Clzp, diazóxido (Dzx, un abridor de los canales mKATP), Ru-360 (un selectivo inhibidor del UCam) y ciclosporina-A (Cys-A, un inhibidor del mPTP, antes de la isquemia y durante todo el período de reperfusión). El agregado de 5-HD a CPG incrementó el Ht sin afectar la RCPI ni el tono diastólico, pero la adición de Clzp 30 µM a este pretratamiento redujo la RCPI con un aumento en el tono diastólico y el Ht. El pretratamiento con Dzx protegió a los corazones de rata no cadiopléjicos pero aumentó el atontamiento en los corazones pretratados con CPG disminuyendo la economía muscular total (P/Ht). Similar comportamiento se produjo en corazones pretratados con Ru-360 + CPG. En cambio, el pretratamiento con Cys-A en corazones con y sin CPG, y en la R, no modificó el comportamiento mecánico-energético, sugiriendo que el mPTP no se abre en este modelo de I/R reversible. Estos resultados sugieren que en corazones de rata cardiopléjicos las intervenciones que disminuyen la [Ca2+]m reducen la RCPI y la economía muscular (P/Ht) y sugieren que la [Ca2+]m contribuye a regular la recuperación contráctil durante la reperfusión. Para evaluar el efecto de la CPG sobre la toma de Ca2+ mitocondrial y el manejo del Ca2+ por el RS se midió mediante microscopía confocal los niveles de Ca2+ mitocondriales y citosólicos y el potencial de membrana mitocondrial (m) en cardiomiocitos de rata, y se correlacionó con la respuesta mecánico-calorimétrica en corazones perfundidos. La CPG no modificó la señal de JC-1 (ΔΨm) pero aumentó transitoriamente las señales de Fura-2 ([Ca2+]i) y de Rhod-2 ([Ca2+]m) de las células en reposo, ambas con posterior caída exponencial. El bloqueo de la SERCA por adición de tapsigargina (Tpg) incrementó la fluorescencia de Rhod-2 en un grupo de células sin afectar la señal de Fura-2. En los corazones de rata en reposo y perfundidos con CPG, el agregado de Tpg disminuyó el flujo de calor total (ΔHr: -0.44±0.07 mW/g) mientras que la adición de KB-R7943 incrementó la presión de reposo. Estos resultado sugieren que la despolarización inducida por CPG provoca un incremento en la [Ca2+]i y la [Ca2+]m (sin cambios en ΔΨm) que decae a causa de los mecanismos de remoción exotérmicos. Tanto la captación de Ca2+ mitocondrial como la SERCA contribuyen a remover el Ca2+ citosólico durante el arresto cardiopléjico, aunque la SERCA representa el principal mecanismo de gasto de energía del tejido. Dado que especies como el conejo y el cobayo tienen menor desarrollo sarcoreticular que el corazón de rata adulta, surgió la hipótesis de la existencia de una interacción funcional RS-mitocondria diferente en estas especies. Para evaluar esta hipótesis se estudiaron mecánico-calorimétricamente los corazones de cobayo cardiopléjicos sometidos a un modelo reversible de I/R. El pretratamiento con CPG protegió levemente a los corazones sometidos a 30 minutos de isquemia y 45 minutos de reperfusión. La adición de Clzp al pretratamiento con CPG potenció la protección cardiopléjica, comportamiento opuesto al obtenido en corazones de rata en similares condiciones experimentales. Cuando los corazones expuestos a los 3 tratamientos se reperfundieron con Krebs + cafeína 10 mM + 36 mM Na+ no hubo diferencias en las áreas bajo la curva de rLVP, aunque Clzp redujo el ΔHt asociado a la misma, sugiriendo que la cardioprotección de CPG+Clzp no está relacionada con un aumento significativo del reservorio de Ca2+ del RS sensible a cafeína, pero el NXCm podría participar en regularlo. El pretratamiento con KB-R7943 en CPG no modificó la recuperación mecánico-energética post-isquémica en los corazones de cobayo, por lo que el uniporter y el NXCSL en modo reversa no afectarían la RCPI o cancelan sus efectos sobre el transitorio de Ca2+ citosólico. En cambio, la activación de los mKATP con diazóxido (Dzx) en CPG aumentó la RCPI sin cambios en el flujo de calor total (Ht). Estos resultados son opuestos a los obtenidos en corazones de rata cardiopléjicos. Cuando los corazones de cobayo se pretrataron con CPG + ouabaína aumentó la RCPI pero también provocó contractura diastólica. El efecto no fue potenciado por el agregado de Clzp al pretratamiento, aunque éste redujo el Hr durante la CPG. Se concluye que ouabaína y Clzp afectan en forma opuesta al NXCm. Los resultados obtenidos en corazones de cobayo expuestos a un modelo de I/R reversible sugieren que el rol del NXCm es diferente al encontrado en corazones de rata. Tanto el pretratamiento con Clzp como con Dzx son cardioprotectores, el segundo por un efecto estimulante del metabolismo mitocondrial, y el primero por aumentar la [Ca2+]m. Esto podría favorecer la fracción de Ca2+ mitocondrial después de la reversión del bloqueo del NXCm. Factores tales como la [Na+]i y el reservorio del RS generarían las diferencias de comportamiento del clonazepam y diazóxido en corazones de rata y cobayo. Esta tesis constituye el primer estudio miotérmico de la isquemia y reperfusión cardíaca, y soporta el rol regulador de las mitocondrias en corazones pretratados con cardioplejia de alta [K+]e. Esto aporta un conocimiento importante sobre la economía cardíaca de corazones expuestos a procesos quirúrgicos, y pone énfasis en el actualmente más comprobado rol de las mitocondrias como reguladoras importantes de la homeostasis de Ca2+ en situaciones patológicas. También alerta acerca de los riesgos del uso de ciertas drogas durante las intervenciones cardioplejicas, tales como el clonazepam, diazóxido, cardiotónicos, KB-R7943 y Ru-360, conocidas como protectoras en corazones no cardiopléjicos, que pueden empeorar el desempeño mecánico energético de corazones cuya relación funcional mitocondria-RS sea más parecida a la de rata que al cobayo, es decir en estados con alta [Na+]i y [Ca2+]i.
Doctor en Ciencias Exactas, área Ciencias Biológicas
Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Exactas