Regulación de la transcripción del RNA S de arenavirus : Análisis de la interacción de la proteína N del virus Junín con el RNA y el ion zinc

• Autores: Tortorici, María Alejandra
• Año de publicación: 2000
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Romanowski, Víctor
• Materia: Biología; Arenavirus; Virus Junín; ADN; ARN
• Institución: Universidad Nacional de La Plata

La familia Arenaviridae está constituida por virus envueltos con un genoma compuesto por dos especies de RNA de cadena simple, denominadas L {large, de aprox. 7 kb) y S {small, de aprox. 3,5 kb). El virus Junín, es el agente etiológico de una enfermedad endemo-epidémica denominada fiebre hemorrágica argentina. El RNA S codifica para las proteínas estructurales mayoritarias del virión: el precursor de las glicoproteínas (GPC) y la proteína de nucleocápside (N). Los marcos de lectura están ubicados en orientación opuesta (estrategia de codificación ambisentido; Auperin et al., 1984) y separados por una región intergénica no codificante que se pliega formando una estructura secundaria muy estable tipo stem loop (Ghringhelli et al., 1991). Una vez que el virus penetra en la célula, el RNA S genómico es transcripto, produciéndose dos formas antigenómicas: el mRNA N de 1,8 kb y el RNA S antigenómico de longitud completa de 3,4 kb. El mRNA N es la primer especie transcripta en la célula infectada, y la estructura secundaria de la región intergénica parece ser la señal de terminación transcripcional. En este contexto, el extremo 3’ de los mRNAs del RNA S fue caracterizado usando el ensayo de protección a RNasas. Los resultados mostraron que la transcripción se detiene en diferentes posiciones nucleotídicas en la región intergénica del RNA S viral, mostrando una heterogeneidad en el extremo 3’ en ambos RNAs (mRNA N y GPC). Esta heterogeneidad ya había sido observada en los arenavirus como Tacaribe y LCM (lapalucci et al., 1991; Meyer & Southern, 1993). La proteína N es básica, se traduce a partir del mRNA antigenómico que está codificado en la mitad 3’ del RNA S viral (Romanowski, 1993) y cumple una función doble durante el ciclo de infección viral. Se asocia fuertemente con el RNA genómico formando la nucleocápside y es esencial en la replicación del genoma viral promoviendo la síntesis de las formas replicativas durante el ciclo de infección (Lee et al., 2000, Tortorici et al., 2000a). El resultado del análisis computacional de la secuencia de la proteína N muestra que pertenece a una única familia de proteínas con tres regiones con capacidades potenciales de unión a RNA. La región amino terminal contiene un segmento con una secuencia similar al arginine rich motif {ARM) dentro de una región con cargas mixtas. La región media presenta un dominio atípico RNP-1. Finalmente, la secuencia CX2HX23CX4C en el extremo carboxilo-terminal, se asemeja al clásico motivo zinc finger (Parisi etal., 1996). En este trabajo de Tesis se estudió la capacidad de unión a zinc in vitro de la proteína N del virus Junín expresada en Escherichia coli. La región de unión se caracterizó por medio del análisis de una serie de mutantes de deleción y/o puntuales de la proteína N. Los resultados experimentales mostraron que la actividad de unión a zinc se localiza en la zona carboxilo terminal de la proteína N y la sustitución de ciertos aminoácidos críticos en el dominio tipo zinc finger aislado, elimina la unión a zinc. Sin embargo, sitios alternativos de unión a zinc parcialmente superpuestos o en la región inmediatamente adyacente al dominio zinc finger pueden unir zinc con una afinidad ligeramente menor (Tortorici etal., 2000b). La proteína N expresada en E. coli también se utilizó en ensayos de unión a la región intergénica (IGR) del RNA S viral. En concordancia con las funciones estructural y regulatoria descriptas para la proteína N, ésta mostró su capacidad de unión a dicha región. Por medio de la utilización de mutantes puntuales y/o de deleción se logró mapear la región de la proteína necesaria para la interacción con la secuencia IGR del RNAS. En presencia de inhibidores de síntesis de proteínas la transcripción inicial del genoma de los arenavirus se interrumpe en la región intergénica, detectándose únicamente el mRNA de la proteína N (Franze-Fernández et al., 1987; Rivera-Pomar, 1991; Albariño, 1997). De manera que, como para la síntesis del RNA S antigenómico full length se requiere la síntesis de proteínas, se analizó si la proteína N podría actuar como antiterminador transcripcional. Este evento se evaluó experimentalmente, infectando una línea celular que contenía proteína N, en presencia de inhibidores de la síntesis de proteínas. El resultado de este ensayo confirmó la participación de la proteína de la nucleocápside en el proceso de antiterminación transcripcional (Tortorici et al., 2000a). Además, los resultados de experimentos con versiones truncadas del gen N muestran que el dominio funcional está localizado en el extremo amino terminal (dominio tipo ARM) de la proteína N.
Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la colaboración de la Biblioteca de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).
Doctor en Ciencias Exactas
Universidad Nacional de La Plata
Facultad de Ciencias Exactas