Estudio de microambiente hipóxico y del metabolismo lipídico del carcinoma renal de células claras (crcc)

• Autores: Melana Colavita, Juan Pablo
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Aguirre, María Victoria; Rodríguez, Juan Pablo
• Materia: Microambiente hipóxico; Metabolismo lipídico; Carcinoma renal; Células claras; CRCC; Riñones; Cáncer
• Institución: Universidad Nacional del Nordeste

Fil: Melana Colavita, Juan Pablo. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura; Argentina.
Fil: Aguirre, María Victoria. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina.
Fil: Rodríguez, Juan Pablo. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Medicina; Argentina.
El cáncer de riñón representa el 2,5% de todos los cánceres, con una incidencia mundial de 300.000 casos, los cuales conducen a 111.000 óbitos anuales. El carcinoma renal de células claras (CRCC) es el subtipo más común de carcinoma de células renales (CCR), denominado de esta manera por el aspecto claro del citoplasma celular, consecuencia del alto contenido lipídico. Aunque en la actualidad se están diseñando y aplicando nuevos tratamientos terapéuticos basados en la combinación de inhibidores de tirosina quinasa e inmunoterapias, el CRCC se presenta como una entidad oncológica compleja de difícil predicción. Existe, por lo tanto, un gran interés de conocer las bases moleculares de la biología tumoral del CRCC, lo cual podría contribuir a una mejor comprensión del comportamiento biológico agresivo de este cáncer e identificar biomarcadores tempranos de la enfermedad, así como también blancos terapéuticos que frenen la proliferación de este tipo de células malignas. El objetivo general de esta tesis doctoral consistió en estudiar las moléculas involucradas en el microambiente hipóxico del CRCC y profundizar en los roles de la estearoil CoA desaturasa de tipo 1 (SCD-1) y de la proteína de resistencia a múltiples fármacos de tipo 4 (MRP4) en la regulación de la proliferación tumoral, con el objeto de validarlos como posibles dianas terapéuticas o biomarcadores diagnósticos y/o predictivos de esta afección maligna. SCD-1 cataliza la introducción de un doble enlace en varios acil-CoA grasos saturados, principalmente estearoil-CoA, para sintetizar ácido oleico (18:1n-9). Este producto enzimático participa en la proliferación, señalización e invasividad de las células tumorales. Mientras que MRP4, expresado débilmente en la membrana apical de los túbulos renales contorneados proximales, se encarga de bombear una serie de compuestos exógenos y endógenos del espacio intracelular al extracelular. Entre los componentes que extruye MRP4 se encuentran diversos fármacos antitumorales y el AMPc (importante segundo mensajero implicado en procesos de proliferación celular). Es así, que, en este trabajo, se presenta información novedosa respecto a la biología tumoral del CRCC, en la cual se aborda el estudio del microambiente hipóxico y su influencia sobre la expresión/actividad de un conjunto de proteínas implicadas en los procesos de proliferación, supervivencia y apoptosis de células tumorales. Por lo tanto, se han estudiado a través de estudios multiparamétricos: los factores inducibles por hipoxia de tipo 1 y 2 (HIF-1α y HIF-2α), eritropoyetina y su receptor (EPO y EPO-R), el factor de crecimiento endotelial vascular y su receptor (VEGF y VEGFR-2), SCD-1 y MRP4. La metodología de trabajo incluyó diversas técnicas, entre ellas: cultivos celulares, biología molecular, Western blot, inmunohistoquímica e inmunocitoquímica, ensayos de viabilidad y proliferación celular, radioinmunoensayos, espectrometría de masas, citometría de flujo y microscopias (óptica, fluorescente directa y confocal). Los resultados obtenidos revelaron que HIF-1α, EPO, EPO-R, VEGF, VEGFR-2, SCD-1 y MRP4 fueron sobreexpresados en la mayoría de las muestras tumorales de CRCC obtenidas por nefrectomía. Las relaciones directamente proporcionales entre los pares HIF-1α/SCD-1 y SCD- 1/Ki-67 sugirieron un vínculo entre estas moléculas, implicadas en la progresión tumoral en primeras etapas del CRCC. Los análisis lipidómicos de los tumores y las líneas celulares de CRCC, demostraron que el 18:1n- 9 fue uno de los principales ácidos grasos comprometidos y particularmente el más abundante en la fracción de lípidos neutros en el core tumoral. Utilizando un modelo in vitro de hipoxia química sobre la línea celular CAKI-2 (línea de CRCC), se halló una sobreexpresión de SCD-1. El aumento en la expresión de SCD-1 causó un incremento en los niveles de 18:1n-9, que a su vez, se acumuló en la fracción lipídica neutra. La inhibición farmacológica de SCD-1 bloqueó la síntesis de 18:1n-9 y comprometió la proliferación celular. Mientras que la adición de 18:1n-9 exógeno a las células revirtió los efectos de la inhibición enzimática sobre la proliferación celular. Por otra parte, también se encontró una sobreexpresion de MRP4 al utilizar el modelo in vitro de hipoxia química sobre la línea celular CAKI-2. El bloqueo farmacológico de MRP4 en células CAKI-2, generó un desequilibrio en el metabolismo del AMPc, induciendo la detención del ciclo celular, cambios en la composición de lípidos, aumento de lipid droplets (LD) citoplasmáticos y finalmente la apoptosis. Estos datos revelan por primera vez que, tanto SCD-1, enzima clave de los niveles de ácido oleico, como MRP4, moduladora de las concentraciones intracelulares de AMPc, son proteínas cruciales de control de dos procesos bioquímicos coexistentes vinculados a la proliferación de células tumorales y sensibles a la hipoxia. En conclusión, durante el desarrollo de esta tesis se comprobó que las dos proteínas estudiadas, SCD-1 y MRP4 presentaron firmes evidencias experimentales para ser utilizadas como posibles biomarcadores y/o blancos terapéuticos para CRCC.
Kidney cancer represents 2.5% of all cancer tumors, with a worldwide incidence of 300,000 cases, which lead to 111,000 deaths annually. Clear cell renal carcinoma (CRCC) is the most common histological subtype of renal cell carcinoma (CRC). Its name indicates the clear appearance of the cell cytoplasm, due to the high lipid content, observed in this cancer. Although new therapeutic strategies are currently being designed (a combination of tyrosine kinase inhibitors and immunotherapies), CRCC appears as a complex oncological entity that is difficult to predict. Thus, there is great interest to know the molecular bases of the tumor biology of CRCC, which could contribute to a better understanding of the aggressive biological behavior of this cancer and identify early biomarkers, as well as therapeutic targets that stop the proliferation of this type of malignant cells. The objective of this doctoral thesis was to study the molecules involved in the hypoxic microenvironment of CRCC and to delve into the role of stearoyl CoA desaturase type 1 (SCD-1) and multidrug resistance protein type 4 (MRP4) in the regulation of tumor proliferation, in order to validate them as possible therapeutic targets or diagnostic and / or predictive biomarkers of this malignant condition. SCD-1 catalyzes the introduction of a double bond in several saturated fatty acyl-CoAs, mainly stearoyl-CoA, to synthesize oleic acid (18:1n-9). This enzymatic product participates in the proliferation, signaling and invasiveness of tumor cells. On the other hand, MRP4 is weakly expressed in the apical membrane of the proximal convoluted renal tubules and is responsible for pumping exogenous and endogenous compounds from the intracellular to the extracellular space. Among the components that MRP4 extrudes are antitumor drugs and cAMP (second messenger involved in cell proliferation processes). This thesis provides novel information regarding the tumor biology of the CRCC, focused on the hypoxic microenvironment and its influence on the expression / activity of a set of proteins involved in the processes of proliferation, survival and apoptosis of tumor cells. Thus, type 1 and 2 hypoxia-inducible factors (HIF-1α and HIF-2α), erythropoietin and its receptor (EPO and EPO- R), vascular endothelial growth factor and its receptor (VEGF and VEGFR-2), SCD-1 and MRP4 were studied through multiparametric studies. Materials and methods included: cell cultures, qPCR, Western blot, immunohistochemistry and immunocytochemistry, cell viability and proliferation assays, radioimmunoassays, mass spectrometry, flow cytometry and various microscopic techniques (optical, direct fluorescent and confocal) . The results obtained revealed that HIF-1α, EPO, EPO-R, VEGF, VEGFR-2, SCD-1 and MRP4 were overexpressed inmost CRCC tumorsamples obtained by nephrectomy. The directly proportional relationships between the HIF-1α / SCD-1 and SCD-1 / Ki-67 pairssuggested a link between these molecules, involved in early-stage tumor progression of CRCC. Lipidomic analyzes of tumors and CRCC cell lines showed that 18:1n-9 is increased in these tumors and is particularly abundant in the neutral lipid fraction in the tumor center. Using an in vitro model of chemical hypoxia on CAKI-2 cell line (CRCC line), we found a SCD-1 overexpression. This caused an increase in 18:1n-9 levels, which, in turn, was accumulated in the neutral lipid fraction. The pharmacological inhibition of SCD-1 blocked the 18:1n-9 synthesis and compromised cell proliferation, demonstrating its importance in the process. On the other hand, a MRP4 overexpression was also found when using the in vitro model of chemical hypoxia on CAKI-2 cell line. The pharmacological blockade of this transporter in CAKI- 2 cells, generated an imbalance in cAMP metabolism, and induced the arrest of the cell cycle, changes in lipid composition, increase in cytoplasmic lipid droplets and finally apoptosis. These data reveal for the first time that both SCD-1, a key enzyme for the synthesis of oleic acid, and MRP4, which modulatesintracellular cAMP concentrations, are both crucial control proteins of two coexisting biochemical processes linked to the proliferation of tumor cells and sensitive to hypoxia. In conclusion, during the development of this thesis, it was found that the two proteins studied, SCD-1 and MRP4, presented strong experimental evidence to be used as possible biomarkers and / or therapeutic targets for CRCC.