Estudio de parámetros inmunológicos y moleculares asociados al desarrollo de alta o baja carga proviral en animales infectados con el virus de la leucosis bovina (BLV)

• Autores: Lendez, Pamela Anahí
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ceriani, María Carolina; Dolcini, Guillermina
• Materia: Ciencias veterinarias; Medicina veterinaria; Grandes animales; Bovinos de leche; Patología animal; Enfermedades infecciosas; Sanidad animal; Leucosis bovina enzoótica; LBE; Tesis de doctorado
• Institución: Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires

La leucosis bovina enzoótica (LBE) es una enfermedad infecto-contagiosa, de curso crónico, que afecta naturalmente al ganado bovino presentando una mayor prevalencia en los rodeos lecheros debido a las prácticas de manejo propias de esta producción. El agente causal de los diferentes desordenes linfoproliferativos asociados a esta enfermedad es un deltaretrovirus denominado virus de la leucosis bovina (BLV), que infecta a los linfocitos B, integrándose a su genoma bajo la forma de provirus. La infección por BLV responde al fenómeno iceberg: sólo un 5 –10% de animales mueren por linfosarcoma luego de un extenso período de latencia, un 30% desarrolla linfocitosis persistente (LP), una expansión policlonal benigna de linfocitos B circulantes en sangre periférica, sin alteraciones morfológicas ni funcionales, que se mantiene durante toda la vida del animal. El resto de los animales, que componen la base del iceberg, permanecen asintomáticos y representan el 70% de la población infectada. Los animales linfocitóticos presentan una alta carga proviral, un elevado título de anticuerpos contra el virus y un alto número de linfocitos infectados, e integran lo que definimos como el perfil de alta carga proviral (ACPV). Del resto de los animales infectados, un 40% se corresponde con el perfil de ACPV y el 60% restante con el perfil de baja carga proviral (BCPV) caracterizado por un escaso número de linfocitos infectados en sangre periférica, lo que se refleja en una carga proviral prácticamente indetectable y muy bajo título de anticuerpos contra el virus. Varias investigaciones han intentado explicar la existencia de estos dos perfiles de infección determinando que existen factores virales, genéticos, epigenéticos, inmunológicos y ambientales que estarían contribuyendo en su desarrollo. En este trabajo de Tesis se abordaron algunos de estos aspectos. Se analizó el polimorfismo genético en la posición -824 de la región promotora del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) bajo la premisa de que este polimorfismo podría influenciar la expresión diferencial de dicho gen y tener consecuencias en el desarrollo de la enfermedad. Se observó una asociación significativa entre la carga proviral y la baja frecuencia del genotipo G/G en esta región entre los animales de BCPV. Este genotipo se asocia a una menor actividad transcripcional del promotor en los animales con linfosarcoma inducido por BLV y a una mayor tendencia a desarrollar ACPV. Nuestros resultados reafirman la participación de factores genéticos en la respuesta inmune de los animales y por consiguiente en la patogénesis viral. Desde el punto de vista estrictamente inmunológico, el TNF-α es una citoquina fundamental en la respuesta de los animales frente a las infecciones virales. Diferentes autores han postulado que esta citoquina y sus receptores, TNFRI y TNFRII, juegan un papel importante en la patogénesis de la LBE. En esta Tesis se cuantificó la expresión del ARNm de dichos mediadores en animales que desarrollan ACPV y BCPV en dos momentos del año (verano y primavera)y se observó una asociación significativa entre la expresión de ARNm de TNF-α, TNFRI y TNFRII y el desarrollo de los diferentes perfiles de infección, y que la expresión de estos mediadores difería según el momento del año evaluado. Los resultados obtenidos en el período de verano demostraron una tendencia a una mayor expresión de ARNm de TNF-α y menor expresión de ARNm de sus receptores en los animales con ACPV respecto a los animales con BCPV. En el período de primavera, se observó que los animales de BCPV mantuvieron un perfil de expresión de ARNm de TNF-α similar al de los animales BLV (-), mientras que los animales de ACPV presentaron una respuesta antiviral exacerbada, particularmente los animales que desarrollaron LP. Estas observaciones apoyan la hipótesis de que los animales con ACPV presentan un perfil anti-apoptótico y pro-proliferativo mientras que los animales de BCPV pueden ser controladores de la infección/diseminación viral, y que tanto el TNF-α y sus receptores influirían en el desarrollo de estos perfiles de infección. Sobre la base de las diferencias en los resultados obtenidos en ambos períodos se postuló que estas podrían deberse al efecto del estrés por calor que sufrieron los animales en el mes de verano. Para este estudio se seleccionaron animales de establecimientos de nuestra región, que se caracteriza por una diferencia marcada de temperatura entre ambas estaciones del año. El aumento de la temperatura global, del número de vacas lecheras de alta producción y la intensificación de los sistemas productivos obligan a los animales a recurrir a procesos fisiológicos de regulación térmica con efectos negativos sobre su potencial productivo, reproductivo y sobre su sistema inmune. Este estudio es el primero que evalúa el patrón de expresión de ARNm de TNF-α y sus receptores en vacas lecheras expuestas a estrés por calor y su influencia en el sistema inmune de los animales infectados con BLV. Los resultados obtenidos demuestran que el estrés por calor disminuye la expresión del ARNm de los genes estudiados en vacas lecheras de alta producción pero que no influye de la misma manera en los animales que desarrollan los diferentes perfiles de infección asociados al BLV. Por otra parte, se evaluó el efecto de la reactivación viral y de la estimulación con TNF-α recombinante (rTNF-α) en la expresión de ARNm de TNF-α y sus receptores en los PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) provenientes de bovinos BLV (+) con diferentes perfiles de infección. Si bien los resultados obtenidos en ambos ensayos fueron similares, se observó una menor expresión de ARNm de TNF-α en los animales BLV (+), una mayor expresión de ARNm de TNFRI en animales de BCPV, que apoyaría la hipótesis de que los mismos frente a la reactivación viral, presentan un estado pro-apoptótico y anti-proliferativo, y una menor expresión de ARNm de TNFRII en los animales de ACPV. También se evaluó la proliferación espontánea de los PBMCs provenientes de animales BLV (+) y BLV (-) bajo la premisa que la proliferación celular espontánea in vitro podría correlacionarse con la progresión de la enfermedad. Se observó proliferación espontánea de los PBMCs provenientes de animales BLV (+) en condiciones estándar de cultivo lo que podría deberse a la reactivación del virus. También se evaluó la respuesta linfoproliferativa de los animales en estudio frente a dos estímulos exógenos: rTNF-α y rsTNFRII (proteína recombinante desarrollada en este trabajo de Tesis). Se observó que, ante una estimulación exógena, los animales BLV (-) presentan una respuesta proliferativa mayor que los animales BLV (+) lo que indica que la infección por BLV compromete la respuesta inmune de los animales infectados por el mismo. Además, se vio que la respuesta proliferativa de los animales con ACPV y BCPV difería frente a los estímulos exógenos. Así, los animales de ACPV presentaron mayor respuesta proliferativa al ser estimulados con rsTNFRII y una tendencia a un estado anti-apoptótico y pro-proliferativo, sugiriendo un rol activo de este receptor en el desarrollo de este perfil. Lograr entender los mecanismos por los cuales los animales desarrollan diferentes respuestas frente a la infección por BLV es de suma importancia. Esto permitiría adoptar medidas tendientes a disminuir la prevalencia de dicha infección en los rodeos lecheros, así como también las pérdidas económicas relacionadas con esta enfermedad. La alta prevalencia de infección en los tambos de nuestro país hace difícil aplicar las medidas de control adoptadas por otros países con el fin de erradicar el virus. Por esta razón, y por la falta de una vacuna disponible en el mercado, es que proponemos el reemplazo gradual de los animales que desarrollan ACPV por animales con BCPV tomando como premisa que estos últimos logran controlar la diseminación/infección viral, manteniendo un sistema inmune competente lo que se traduce en una menor eficiencia para transmitir el virus.
Fil: Lendez, Pamela Anahí. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Ceriani, María Carolina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Fil: Dolcini, Guillermina. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Enzootic bovine leukemia (EBL) is an infectious-contagious chronic disease, which naturally affects cattle, with a major prevalence among dairy herds, due to managing conditions. The causal agent of the many lymphoproliferative disorders associated to thisdisease is the bovine leukemia virus (BLV), a deltaretrovirus that mostly infects B lymphocytes, integrating into its genome as a provirus. BLV infection follows the typical iceberg infection model, only 5-10% of the infected animals die of lymphosarcoma, after a long latency period, 30% develop persistent lymphocytosis (PL) a benign polyclonal expansion of peripheral blood circulating B lymphocytes, which remains constant for the entire life of the animal, without morphological or functional alterations. The rest of the animals, which integrate the bottom of the iceberg, remain asymptomatic and represent 70% of the infected universe. Lymphocytotic animals carry a high proviralload, high antibody titers against the virus and an elevated number of infected lymphocytes, and they comprise what we call high proviral load profile (HPL). Of the remaining infected animals, 40% are included in the HPL profile, meanwhile the remaining 60% are included in the low proviral load profile (LPL). This profile is characterized by an exiguous number of infected lymphocytes in peripheral blood, which reflects in an undetectable proviral load by conventional methods and a very low antibody titer against the virus. In an attempt to explain the occurrence of these two infection profiles, several researchers have determined that a combination of viral, genetic, epigenetic, immunological and environmental factors could help to its existence. In this thesis, the genetic polymorphism in position -824 of the promoter region of tumor necrosis alpha factor (TNF-α), was analyzed, under the premise that this polymorphism could influence differential expression of the gene, and therefore could have consequences in the disease development. It was observed a significant association between the proviral load and the low frequency of G/G genotype in this region, among the LPL animals. This genotype is associated with a decreased transcriptional activity of the promoter in animals with BLV induced lymphosarcoma, and an increasing trend to develop high proviral load. Our results reassure the genetic factors involvement in the immune response, and hence in viral pathogenesis. Strictly from an immunological point of view, TNF-α is a key cytokine in animal ́s response against viral infections. Several authors have postulated that this cytokine and its receptors, TNFRI and TNFRII, play a fundamental role in EBL pathogenesis. In this thesis mRNA expression of such mediators in HPL and LPL animals in two different times of the year was determined (summer and spring), and a significant association between mRNA expression of TNF-α, TNFRI and TNFRII and the development of the different infection profiles was observed. These mediators expression was influenced or affected by the time of the year the samples were taken. The results show that during the summer, there was a tendency to a higher expression of TNF-α and a lower expression of its receptors in HPL animals compared to LPL animals. During the spring, where temperatures are milder, LPL animals mRNA expression profiles were comparable to non-infected animals, meanwhile HPL animals showed an exacerbated antiviral response, particularly those animals with PL. These observations support the hypothesis that HPL animals have an anti-apoptotic and pro-proliferative profile, whilst the LPL animals might beconsidered as infection/viral dissemination controllers, and that TNF-α and its receptors might influence in the development of these different infection profiles. Relying on the differences found in both seasonal periods, we postulated that these differences could be due to heat stress suffered by the animals during the summer period. Animals belonging to dairy milks near our University were selected. Our institution is located in a geographical region characterized by a marked temperature difference between the two seasons. The raise in global temperature, the permanent increasing number of high performance milky cows and the intensification of productive systems, force the animals to resort to physiological processes of thermic regulation, with negative effects over its productive potential and its immune system. This is the first report that evaluates mRNA expression pattern of TNF-α and its receptors in dairy cows exposed to heat stress, and its influence in BLV infected animals immune system. The obtained results show that heat stress diminishes mRNA expression of the evaluated genes in high performance cows, but its influence varies depending on the infection profile of the animal.On the other hand, the effect of viral reactivation and stimulation with recombinant TNF-α (rTNF-α) and its effect on mRNA expression of TNF-α and its receptors was evaluated in PBMC isolated from BLV infected animals with different infection profiles. The results obtained in both experiments were similar. It was observed a lower expression of TNF-α mRNA in BLV infected animals, a higher expression of TNFRI mRNA in animals included in the LPL group, which supports the hypothesis that these animals, facing viral reactivation, show a pro-apoptotic and anti-proliferative state, and a lower expression of TNFRII mRNA in HPL animals.Spontaneous proliferation of PBMC from BLV (+) and BLV (-) animals was also evaluated, under the premise that this in vitro phenomenoncould correlate with disease progression. Spontaneous proliferation of PBMC from BLV (+) animals was observed in standard culture conditions. Proliferative response was evaluated also after addition of twoexogenous stimuli: rTNF-α(commercial recombinant TNF-α) and rsTNFRII (recombinant protein developed for this thesis). It was observed that when exposed to an exogenous stimulation, BLV (-) animals showed an increased proliferative response compared to BLV (+) animals, which might indicate that BLV infection compromises immune response. Besides, it was shown that the proliferative response between HPL and LPL was different with the different stimuli. So, HPL animals had a greater proliferative response when stimulated with rsTNFRII, and a trend towards an anti-apoptotic and pro-proliferative status, suggesting an active role of this receptor in the development of this profile.Trying to understand the mechanisms by which animals develop either profile after BLV infection is a very important issue. This could allow us to establish measures attempting to diminish the infection prevalence in the dairy herds, and to alleviate the economic losses related to this disease. The high infection prevalence in dairy herds of our country makes unfeasible to apply control measures which were successful in other countries in order to eradicate the virus. For this reason, and until a successful vaccine is available, our proposal is to gradually replace HPV animalsby LPL animals, with the knowledge that these animals are capable of controlling viral dissemination, maintaining a competent immune system, ending up ina lesser efficiency totransmit the virus.