Biointerfaces funcionales nanoestructuradas modificadas con aptáremos y ácidos nucleicos como elementos de reconocimiento biomolecular

• Autores: Jalit, Yamile
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Rodríguez, Marcela Cecilia; Briñon, Margarita Cristina; Granados, Alejandro Manuel; Rivas, Gustavo Adolfo; Raba, Julio
• Materia: Polilisina; Trombina; Ácidos nucleicos; Biosensores; Biosensores electroquímicos; Biomoléculas; Aptámero; Electrodos
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2013.
Fil: Jalit, Yamile. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Esta Tesis Doctoral se basó en el diseño, caracterización y empleo de nuevas plataformas de biorreconocimiento para la inmovilización y detección de diversas biomoléculas, principalmente, ácidos nucleicos y proteínas. El objetivo de este estudio fue contribuir al diseño racional de nuevos biosensores, empleando aptámeros como elementos de reconocimiento biomolecular y homo-oligonucleótidos, en el estudio del evento de hibridación. La adsorción y electro-oxidación de ácidos nucleicos es un proceso complejo que depende de varios factores, tales como la naturaleza del transductor y los pre-tratamientos realizados, el tipo de electrolito soporte, el tiempo de interacción/adsorción, el tipo de molécula de ADN (simple o doble hebra), la longitud de la cadena conjuntamente con el contenido de residuos guanina y su accesibilidad una vez que la secuencia de ADN es inmovilizada. Los estudios de caracterización y detección de los ácidos nucleicos fueron abordados a partir de técnicas electroquímicas, ópticas y acústicas, sobre una amplia variedad de superficies sólidas: electrodos de carbono vítreo y electrodos serigrafiados con tinta de carbono sin modificar y modificados con dispersiones de nanotubos de carbono, y electrodos de oro. Inicialmente, se llevó a cabo el diseño y caracterización de una nueva dispersión de nanotubos de carbono de pared múltiple en una solución de poli-L-lisina (polímero de cadena electropositiva) para modificar transductores de carbono vítreo. Este sistema fue estudiado empleando diversos marcadores electroactivos y diferentes técnicas electroquímicas y de caracterización superficial, a fin de obtener información sobre las propiedades de la plataforma diseñada. La plataforma obtenida como resultado de modificar electrodos de carbono vítreo con una dispersión de nanotubos de carbono en una solución de poli-L-lisina, fue empleada para ensayos de adsorción y electro-oxidación del aptámero anti-trombina, ADN de doble hebra de timo de ternera y los homo-oligonucleótidos oligo(dG)11, oligo(dC)11, oligo(dT)11y oligo(dA)20. En este sentido, se investigó su respuesta electroquímica y la influencia del pre- lJanú(e fatit swili Dactwtad tratamiento térmico en la misma, tos tiempos de adsorción electrostática adecuados y el evento de hibridación entre homo-oligonucleótidos complementarios. Asimismo, se presenta la aplicación de novedosos electrodos serigrafiados, que fueron empleados sin ninguna modificación previa o bien, modificados en nuestro laboratorio con nanotubos de carbono, a través de la deposición de dispersiones elaboradas en diferentes solventes. Se realizaron estudios concernientes al pre-tratamiento superficial de los electrodos serigrafiados y se investigó la respuesta de un conjunto de sondas electroquímicas, de manera tal de obtener información concluyente del comportamiento de las especies según el pre-tratamiento realizado. Como resultado de estos estudios se determinó que es crucial la adecuada selección del pre-tratamiento para mejorar la respuesta electroquímica de sondas rédox. Adicionalmente, se efectuaron estudios preliminares de la respuesta de ácidos nucleicos y ensayos de hibridación, revelando nuevas estrategias para el diseño y desarrollo de genosensores. Como punto final, se presentan los resultados obtenidos en el estudio de una nueva plataforma aptasensora para La detección de trombina humana, empleando un aptámero anti-trombina modificado con un grupo biotina. Esta estructura biomolecular fue obtenida empleando una superficie de oro modificada secuencialmente con ácido 4- mercaptobenzoico, estreptavidina y el aptámero anti-trombina. El diseño del aptasensor fue caracterizado utilizando técnicas electroquímicas, ópticas y acústicas. En cada una de las etapas de crecimiento de la plataforma de biorreconocimiento se efectuó el estudio exhaustivo de las condiciones más apropiadas para llevar a cabo las respectivas inmovilizaciones moleculares; entre ellas, el tiempo óptimo de interacción en cada etapa de la construcción, los "buffers"adecuados para efectuar los pasos de inmovilización, enjuague y detección y, consecuentemente, el reconocimiento de la molécula de interés. El evento de reconocimiento de trombina humana fue evidenciado por cambios en el ángulo de resonancia de plasmón superficial, producido como consecuencia de la interacción entre el aptasensor y la proteína blanco. Esta plataforma, demostró ser altamente selectiva a trombina humana aún en presencia de un gran exceso de albúmina, Lisozima, citocromo C, mioglobina y trombina bovina, la cual posee un 85 % de homología con la especie humana. Con esta plataforma se alcanzaron límites de detección del orden de nanomolar (picomol en el íwnen y pauwwó cuwe, volumen de muestra empleado) en condiciones de alta selectividad y especificidad, lo cual representa una interesante y promisoria alternativa para la cuantificación de proteínas y otras moléculas pequeñas.
Fil: Jalit, Yamile. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.