Modulación supramolecular de la actividad de esfingomielinasa en biointerfases

• Autores: Fanani, María Laura
• Año de publicación: 2001
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Maggio, Bruno; Caputto, Beatriz Leonor; Beaugé, Luis Alberto; Gerez de Burgos, Nelia Martha
• Materia: Enzimas; Fosfolipasas; Esfingomielinas
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Dr. en Ciencias Químicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2001.
Fil: Fanani, María Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Fanani, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Las esfingomielinasas (Sphmasas) son enzimas que catalizan la hidrólisis de esfingomielina (Sphm) para formar ceramida (Cer) y fosfocolina que están implicadas en eventos de transducción de señales celulares. Al igual que otras fosfolipasas, su acción modifica la composición lipídica de la membrana donde actúa y puede conducir a alteraciones de las propiedades fisicoquímicas de las mismas. En este trabajo de tesis se estudió la acción de Sphmasa frente a monocapas lipídicas con el objetivo de dilucidar si los cambios de propiedades de la membrana donde actúa pueden influir sobre la actividad de otra vía metabólica (en este trabajo fosfolipasa A2) con la que no se comparten intermediarios lipídicos. Para ello se desarrolló una técnica que permite monitorear continuamente la actividad de Sphmasa frente a monocapas de sustrato puro o mezcla de lípidos, manteniendo la organización intermolecular del sustrato controlada. Nuestro estudio de la catálisis interfasial de B. cereus Sphmasa reveló la presencia de un período de latencia, llamado corrientemente "Lag Time", que es anterior a la etapa de catálisis que se desarrolla con velocidad constante. La actividad Sphmasa depende, de manera reversible, de la presión lateral y actúa mas favorablemente sobre el sustrato empaquetado mas laxamente (fase líquido expandida), mientras que lo degrada con dificultad a presiones laterales donde se encuentra en fase mas condensada. Se describió en detalle la cinética interfasial de Sphmasa de B. cereus. Se ensayaron seis modelos cinéticos para dilucidar posibles mecanismos de activación interfasial de la enzima durante el período de latencia. Se concluyó que la cinética de la reacción catalizada por Sphmasa en monocapas de Sphm pura es consistente con un mecanismo que involucra una partición inicial de la enzima a la interfase, un paso posterior que puede ser simulado operacionalmente como un proceso de dependencia bimolecular con la concentración bidimensional de la enzima, seguido de un paso irreversible de activación. La cinética de activación es cinco ordenes de magnitud más lenta que la de catálisis. Concluimos que el establecimiento de un equilibrio entre un 1 Resumen aparente estado monomolecular y bimolecular de la enzima en la interfase, acoplado a un proceso de activación lento, constituiría el paso limitante para explicar la existencia del Lag Time en la reacción catalizada por B. cereus Sphmasa. También se estudió la influencia mutua, a nivel de interfase, entre dos vías fosfohidrolíticas que actúan en biomembranas: las vías catalizadas por Sphmasa y fosfolipasa A2 (PLA2). Los productos y sustratos de una de estas vías fosfohidrolíticas tienen profunda y selectiva influencia sobre la actividad de la otra enzima cuando están presentes en la monocapa-sustrato a baja proporción molar (10%). Ésta modulación no está mediada por una interacción directa de los lípidos analizados con la enzima, sino que es un efecto que ocurre en la interfase. Estos resultados indicaron que la formación a nivel de membrana de productos derivados de una vía degradativa contiene información que es detectada y puede regular marcadamente la actividad de otra vía con la cual no posee intermediarios lipídicos comunes. Esto indica una "intercomunicación" entre ambas vías fosfohidrolíticas que es mediada por las propiedades interfasiales. Nuestras observaciones indican que la modulación cruzada por sustratos y productos de las actividades de Sphmasa y PLA2 es regulada diferencialmente por cambios en la presión de superficie alterando, al menos en dos niveles independientes (las etapas de preactivación interfasial y la de catálisis efectiva) la acción de la enzima asociada a la interfase. Nuestros resultados sugieren que a altas presiones de superficie se produciría un efecto de activación amplificado entre ambas vías fosfohidrolíticas. Este comportamiento cambia dramáticamente a bajas presiones donde la influencia simultanea de ambas vías fosfohidrolíticas puede conducir a una sinérgica disminución de las actividades de ambas enzimas, causando un silenciamiento cooperativo mutuo. Un aumento de la actividad Sphmasa o una disminución en la duración del período de Lag Time no es una consecuencia simple del estado de la interfase (líquido-expandido o líquido-condensado) por cuanto no se correlacionan directamente con interacciones específicas entre los lípidos pertenecientes a cada vía fosfohidrolítica. Sin embargo, se ha encontrado una correlación entre la existencia de dominios segregados lateralmente en monocapas lipídicas con la capacidad de favorecer las etapas precatalíticas (y disminuir el Lag Time) de la cinética de Sphmasa. La modulación interfasial de la acción de Sphmasa por lípidos no sustrato podría ser mediado por alteraciones en la organización global 2 Resumen de la interfase a mediana escala (alteración de la topografía, separación lateral de fases y formación de defectos laterales) mas que por cambios locales de interacciones específicas lípido-lípido. Otro aspecto del trabajo se dirigió a investigar si la formación enzimática de Cer en una interfase puede transmitir información a niveles supramoleculares que excedan el entorno molecular inmediato. Para ello estudiamos la posible variación de la topografía de monocapas monomoleculares de sustrato sometidas a la acción de Sphmasa en tiempo real y las comparamos con las de monocapas de similar composición lipídica, preparadas con proporciones conocidas de lípidos, utilizando la técnica de microscopía de epifluorescencia. Los resultados indican que Cer induce la formación de una fase condensada segregada lateralmente, que influye a un nivel mesoscópico sobre la topografía global de la monocapa. De esta forma se produce una transmisión de información entre eventos que ocurren a nivel de la catálisis enzimática local y fenómenos que ocurren al nivel supramolecular. La microscopía de epifluorescencia revela diferencias sustanciales en la topografía de superficie de monocapas de Sphm conteniendo Cer generada enzimáticamente o por premezcla de lípidos de composición comparable. Es decir que la topografía interfasial contiene información que depende marcadamente no sólo de las proporciones relativas de Sphm y Cer, sino de la manera en que los componentes lipídicos fueron generados. A su vez, los cambios topográficos que tienen lugar en la monocapa a lo largo de la reacción parecen ejercer influencia sobre la propia catálisis. La aparición de dominios segregados lateralmente coincide con el final del período del Lag Time y el momento en que la monocapa alcanza el umbral de percolación de la fase condensada coincide con el alejamiento de la cinética de reacción del régimen de pseudo cero orden. De esta forma, la degradación de Sphm y formación de Cer (eventos a escala molecular local) modifican la topografía global de la interfase (eventos a escala supramolecular) lo cual regula a su vez el comportamiento enzimátíco de Sphmasa (nuevamente a escala molecular). Es decir que existe una transferencia de información multidireccional entre eventos que ocurren a niveles de organización que difieren en órdenes de magnitud.
Fil: Fanani, María Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Fanani, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.