Estudio del sistema de reparación de bases apareadas incorrectamente en Escherichia coli : efecto del contexto cromosómico y de la metilación Dam sobre la tasa de mutación

• Autores: Martina, Mariana Andrea
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Barra, José Luis; Luján, Hugo Daniel; Argaraña, Carlos Enrique; Pellizas, Claudia Gabriela
• Materia: Escherichia coli; Mutación; Genética bacteriana; Reparación del ADN; Biología celular
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencia Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba, 2012
Fil: Martina, Mariana Andrea. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Existen múltiples procesos celulares que directa o indirectamente están involucrados en la regulación de la variabilidad genética. Dentro de este amplio espectro de mecanismos, dos están presentes cada vez que las células se dividen y son los mecanismos relacionados con la fidelidad de la replicación y los asociados a la reparación de los errores producidos durante la replicación. El principal sistema encargado de reparar los errores de la replicación se denomina sistema de reparación de bases apareadas incorrectamente (MRS, del inglés «Mismatch Repair System»). En E. coli el MRS está constituido por cuatro proteínas principales denominadas MutS, MutL, MutH y Dam. En este organismo, el MRS se inicia inmediatamente después de la replicación de la cadena de ADN, mientras todavía se encuentra hemimetilada, es decir, cuando la enzima ADN adenina metiltransferasa (Dam) todavía no ha metilado las secuencias GATC de la cadena hija. La hemimetilación de la cadena de ADN sirve como señal de discriminación de hebra para MutH, una endonucleasa que corta la hebra recientemente sintetizada, en una secuencia GATC no metilada para luego permitir la degradación del ADN que contiene el error y la resíntesis del ADN con la secuencia correcta. El objetivo principal del presente trabajo de tesis estuvo orientado al estudio de algunos factores que participan en el mantenimiento o en la variabilidad de la información genética en bacterias. Más específicamente se analizaron dos aspectos particulares: de qué manera el contexto genómico y la presencia y distribución de las secuencias GATC afectan la fidelidad del proceso de polimerización del ADN y la eficiencia de reparación de errores replicativos; y de qué manera la deficiencia total o parcial de la metilación Dam afecta la estabilidad genética en E. coli. Se encontró que el contexto cromosómico es capaz de afectar tanto la fidelidad del proceso de polimerización del ADN como la eficiencia de reparación de mutaciones replicativas. Por ejemplo, mientras que algunas regiones cromosómicas afectan estos procesos en una dirección (alta fidelidad del proceso de polimerización pero baja eficiencia de reparación del MRS), otras lo hacen en el sentido contrario (baja fidelidad del proceso de polimerización pero alta eficiencia de reparación por parte del MRS). Esta es la primera vez que se reporta un análisis comparativo a nivel genómico, del efecto del contexto genómico no inmediato, tanto sobre la fidelidad de la replicación como sobre la eficiencia de la reparación de los errores de la replicación. A su vez, se observó que el MRS es capaz de reparar eficientemente una mutación cromosómica aun cuando el sitio GATC más cercano se localiza a más de 2 kb de distancia del sitio de mutación. Este resultado contrasta con los reportados para la reparación de mutaciones en plásmidos en donde el MRS no es capaz de reparar una mutación si la secuencia GATC se encuentra a más de 1 kb de la misma. Resumen Por otro lado, también se analizó de qué manera la ausencia completa de metilación Dam puede afectar la estabilidad genética en E. coli. Luego del paso de cultivos bacterianos dom a través de sucesivos cuellos de botella, los linajes descendientes de las cepas deficientes en el gen dom muestran una amplia variabilidad en su frecuencia de mutación, desde mayor a la de la cepa parental hasta considerablemente disminuida. De hecho, luego de unos pocos repliques sucesivos fue posible aislar clones que, aun siendo deficientes en la metilación Dam, manifestaron una frecuencia de mutación similar a la de la cepa salvaje. Este cambio de frecuencia se asoció, al menos en parte, a cambios en el metabolismo celular y no a mutaciones estables en su genotipo. El hecho que la cepa dom pueda modular su frecuencia de mutación tan ampliamente podría conferirles una ventaja adaptativa/evolutiva bajo determinadas condiciones. En este sentido, se verían beneficiadas frente a las cepas salvajes, que por poseer una muy baja frecuencia de mutación demoran más en adaptarse a ambientes nuevos o estresantes. También estarían favorecidas frente a cepas hipermutadoras estables (por ejemplo, cepas deficientes en MutS, MutL o MutH), que si bien podrían adaptarse rápidamente, con el paso del tiempo acumularían mutaciones deletéreas. Esta característica, asociada al hecho que en E. coli enterohemorrágica (EHEC) las cepas dom tendrían incrementada la expresión de algunos factores de virulencia, nos llevó a pensar en la posibilidad de que este tipo de cepas podrían verse seleccionadas bajo ciertas condiciones ambientales. Con el objetivo de analizar esta hipótesis se examinó una colección de 159 aislados de EHEC en busca de cepas sensibles a 2-aminopurina (2AP), un fenotipo característico de las cepas de E. coli deficientes en la metilación Dam. Este análisis nos permitió reportar por primera vez el hallazgo de cepas que tienen afectado el gen dom en aislados naturales. Sin embargo, contrariamente a lo esperado el ADN genómico de estas cepas parecería estar normalmente metilado. Tras el análisis del gen dom de una de estas cepas se encontraron al menos dos mutaciones capaces de generar este tipo de fenotipo. Una de las mutaciones estaría localizada en la región codificante del gen dom y podría interferir directamente en la función de la proteína. La otra mutación estaría localizada en la región promotora del gen dom y podría afectar los niveles o la regulación de la expresión de Dam. Mediante la inserción de un plásmido conteniendo el gen dom conteniendo alguna/s de estas mutaciones fue posible transferir el fenotipo de sensibilidad a 2AP, en presencia de metilación del ADN genómico, a cepas de E. coli de laboratorio. El análisis de estas cepas permitió descubrir otros fenotipos muy interesantes de estas mutantes con el gen dom alterado. Las mismas manifestaron algunos comportamientos similares a las cepas salvajes, otros similares a las cepas completamente deficientes en la metilación Dam, y otros de características intermedias. Además se observó que, si bien las cepas completamente deficientes en la metilación Dam son más sensibles a la luz Uy que las cepas salvajes, las cepas que tienen el gen dam parcialmente alterado tienen una resistencia a la luz Uy significativamente superior a la de la cepa salvaje. La menor susceptibilidad a un agente mutágeno ambiental constituye un ejemplo de un fenotipo que podría conferir a este tipo de cepas, que manifiestan una actividad parcial de genes involucrados en mecanismos de mantención de la estabilidad genética, una ventaja evolutiva/adaptativa frente a cepas salvajes o frente a las cepas que tienen completamente inactivados estos genes, bajo las condiciones ambientales estresantes a las cuales se ven sometidas constantemente las poblaciones bacterianas.tienen el gen dam parcialmente alterado tienen una resistencia a la luz Uy significativamente superior a la de la cepa salvaje. La menor susceptibilidad a un agente mutágeno ambiental constituye un ejemplo de un fenotipo que podría conferir a este tipo de cepas, que manifiestan una actividad parcial de genes involucrados en mecanismos de mantención de la estabilidad genética, una ventaja evolutiva/adaptativa frente a cepas salvajes o frente a las cepas que tienen completamente inactivados estos genes, bajo las condiciones ambientales estresantes a las cuales se ven sometidas constantemente las poblaciones bacterianas.
Fil: Martina, Mariana Andrea. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.