Participación del óxido nítrico y el estrés oxidativo en las alternaciones estructurales de placentas humanas inducidas por la infección con Trypanosoma Cruzi in vitro

• Autores: Triquell, María Fernanda
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fretes, Ricardo Emilio; Gea, Susana Elba; Cervi, Laura Alejandra; Irazoqui, Fernando José; Nowicki, Cristina
• Materia: Placenta humana; Trypanosoma cruzi; Oxido nitrico; In vitro; Estrés oxidativo
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016
Fil:Triquell, María Fernanda. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas; Argentina.
Fil: Fretes, Ricardo Emilio. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas. Cátedra de Biología Celular, Histología y Embriología; Argentina.
Fil: Fretes, Ricardo Emilio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud; Argentina.
Fil: Gea, Susana Elba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.
Fil: Gea, Susana Elba.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Fil: Cervi, Laura Alejandra. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica; Argentina.
Fil: Cervi, Laura Alejandra.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Fil: Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Irazoqui, Fernando José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Fil: Nowicki, Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Química y Fisicoquímica biológicas “Prof. Alejandro C. Paladini”; Argentina.
La placenta es un órgano fundamental para el desarrollo fetal, posee diferentes funciones, transferencia de nutrientes, desechos y gases, metabólicas, inmunológicas, entre otras. Fisiológicamente su estado oxidativo es elevado debido a la alta tasa metabólica que posee, estos niveles de estrés oxidativo se ven exacerbados en diferentes patologías, como las infecciosas. El Trypanosoma cruzi (T. cruzi) agente causal del Chagas, puede ser transmitido en un bajo porcentaje de la madre al feto a través de la placenta. El óxido nítrico (NO) es uno de los principales agentes deletéreos contra T. cruzi y la placenta lo produce a través de la enzima Oxido Nítrico Sintasa endotelial (NOSe), que se localiza en el sinciciotrofoblasto de manera importante. Trabajos previos del laboratorio han demostrado niveles de NO deletéreos para T. cruzi en el espacio intervelloso de la placenta humana. Por lo tanto, nuestro objetivo es Identificar factores placentarios que participan en la invasión y/o infección por Trypanosoma cruzi y mecanismos relacionados que participan en la integridad estructural y funcional de la barrera placentaria conducente a la enfermedad de Chagas congénita. Los Objetivos Específicos son: 1-Determinar modificaciones de la expresión de NOSe, enzima productora de óxido nítrico, inducida por formas infectivas de Trypanosoma cruzi, in vitro. 2-Determinar la influencia de la carga parasitaria y la cepa de Trypanosoma cruzi en el estado de estrés oxidativo de los explantos placentarios en los co-cultivos in vitro. 3- Analizar posibles alteraciones estructurales vellositarias en presencia de las distintas cepas y cargas parasitarias de Trypanosoma cruzi y su relación con el estrés oxidativo. 4-Analizar la modificación o la influencia de las dos cepas de Trypanosoma cruzi en la producción de TNFα y sus receptores solubles en los co-cultivos e placentarios. 5- Cuantificar la infección del tejido placentario modificada por la cepa del parásito y dosis del inóculo, modulada por agentes deletéreos placentarios Material y Métodos: Explantos de vellosidades coriónicas de placentas humanas (n=10) provenientes de embarazadas normales y serológicamente negativas para enfermedades infecto-contagiosas, se co-cultivaron por 24 hs sin parásitos (control) y con 1x106 y 1x105 trypomastigotes de dos poblaciones de T. cruzi, cepas Tulahuen y Lucky (aislada de un caso congénito). Tulahuen pertenece a linaje DTU VI y Lucky fue tipificada en colaboración en laboratorio de Dr. Schijman (INGEBI-CONICET). Dichos cultivos recibieron diferentes tratamientos de acuerdo al objetivo. Resultados según objetivos: Lucky corresponde a DTU II/VI. Altas dosis de parásitos vivos incrementa el ARN (RT-PCR relativa) y proteína de NOSe (western blot e inmunohistoquímica con cuantificación por área marcada e intensidad) en forma significativa. Explantos tratados con parásitos inactivados y en experimento independiente con H2O2 también incrementan NOSe pero en menor magnitud. Nitritos en el medio sobrenadante de cultivo aumentó con las mayores dosis de parásitos pero sin significación estadística. Debido al aumento significativo de NOSe pero sin aumento significativo de nitritos, orientó a la formación de peroxinitritos, motivo del siguiente objetivo. El estado de estrés oxidativo, determinado por inmunohistoquímica y cuantificación de área marcada e intensidad, incrementó significativamente con las dos cepas sobre el control y principalmente con el mayor inóculo de 106 parásitos que fue significativo incluso sobre la dosis de 105 parásitos. La medición de gamma glutamil transpeptidasa (GT) como índice de estrés oxidativo, incrementó significativamente sobre el control y sobre la dosis de 105 parásitos. El aumento de estrés oxidativo inducido por T. cruzi desapareció con los inhibidores de NOSe y de estrés oxidativo, empleando L-NAME y NAC. Estos resultados orientaron a cuantificar posibles lesiones de la barrera placentaria. El estudio estructural incluyó desprendimientos de sinciciotrofoblasto (STB) fueron significativamente mayores con la dosis de 106 de T. cruzi. La dosis de 105 no tuvo diferencias sobre el control sin parásitos. Este efecto fue similar en explantos sin parásito tratados con 200 μM y 500 μM de H2O2 Los desprendimiento de STB inducidos por T. cruzi se revierten significativamente con tratamientos con L-NAME (0,1 y 1 mM) y NAC (5 y 10 mM). Se constató alteración funcional de la barrera placentaria mediante disminución significativa de βhCG en medio sobrenadante con la dosis de 106 de parásitos y con 200 μM y 500 μM de H2O2. La presencia de T. cruzi induce modificaciones del fibrinoide tipo fibrina y tipo matriz del estroma de la vellosidad coriónica, efecto no observado con 200 μM y 500 μM de H2O2. La expresión de NO puede ser gatillada como respuesta inflamatoria innata y por ello se determinó TNFα y sus Recetores 1 y 2 en los medios sobrenadantes de cultivos. TNFα incrementa significativamente con dosis de 106 de T. cruzi y con ambas cepas. Receptores 1 y 2 disminuyen (p<0.05) con Lucky y tienden a disminuir con Tulahuen. Estos resultados pueden condicionar el nivel de infección de la vellosidad coriónica. Por ello se cuantificó infección mediante qPCR. La carga parasitaria en los explantos placentarios es mayor (p<0.05) cuando el inóculo fue de 106 sobre 105. Con L_NAME (0,1 y 1 mM) y NAC (5 y 10 mM) se observa una tendencia a aumentar sin ser significativo. Podemos concluir que el Trypanosoma cruzi estimula la expresión de la enzima NOSe que se localiza principalmente en el STB que es la primera barrera placentaria. Este estímulo es dependiente de la cantidad de parásitos del inóculo, observándose un incremento estadísticamente significativo, de casi dos veces sobre el control en presencia de 106 trypomastigotes. El tejido placentario in vitro exacerba su estado de estrés oxidativo y nitrosativo en presencia del T. cruzi, lo que corrobora por el aumento de residuos de nitrotirosina en las vellosidades coriónicas y por el aumento de la enzima glutamiltranspeptidasa, siendo una respuesta dosis dependiente, cuando la carga parasitaria es muy elevada (comparable con una infección con alta pasitemia) pero también se observa con las cargas parasitarias menores (baja parasitemia). Dentro de los responsables de los daños estructurales en la placenta en presencia de T. cruzi, podemos señalar al NO y sobre todo a los peroxinitritos, ya que pudimos observar que cuando disminuye la producción de los mismos utilizando los tratamientos con L-NAME y NAC, los daños estructurales encontrados fueron menores. El incremento de TNFα como respuesta innata, puede generar el aumento de NO con las consecuencias de estrés oxidativo y alteraciones estructurales y funcionales de la barrera placentaria. Podemos concluir que la infección del tejido placentario es directamente proporcional a la cantidad de parásitos que se encuentran en el sobrenadante placentario, demostrando que si bien se observan algunas diferencias biológicas, (como la sobrevida analizada como motilidad parasitaria), no se observa una diferencia significativa entre ambas cepas en cuanto a la infección de los explantos placentarios. La dosis de inóculo de parásitos dispara mecanismos que modifican la infección y respuesta del tejido placentario en sus etapas iniciales de infección, en donde el NO pudiera participar en el control de la infección.
Fil:Triquell, María Fernanda. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas; Argentina.
Fil: Fretes, Ricardo Emilio. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Médicas. Cátedra de Biología Celular, Histología y Embriología; Argentina.
Fil: Fretes, Ricardo Emilio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud; Argentina.
Fil: Gea, Susana Elba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina.
Fil: Gea, Susana Elba.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Fil: Cervi, Laura Alejandra. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica; Argentina.
Fil: Cervi, Laura Alejandra.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Fil: Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.
Fil: Irazoqui, Fernando José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Fil: Nowicki, Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Química y Fisicoquímica biológicas “Prof. Alejandro C. Paladini”; Argentina.