Rol del citoesqueleto de actina y las proteínas ERM en la formación de esferoides celulares en un modelo de metástasis de cáncer de ovario epitelial

• Autores: Lujea, Noelia Carolina
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Kunda, Patricia
• Materia: Medicina traslacional; Ciencias biomédicas; Esferoides celulares; PERM; E-cadherina; β-tubulina-III
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Fil: Lujea, Noelia Carolina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales; Argentina.
El cáncer de ovario epitelial presenta un alto índice de proliferación y capacidad metastásica. Durante el proceso de diseminación, las células que se liberan del tumor primario son transportadas a través del fluido peritoneal hacia la cavidad peritoneal. A pesar de encontrarse inmersas en un entorno líquido, estas células tienen la capacidad de proliferar y agruparse, formando esferoides tumorales. En este trabajo de tesis, nuestro objetivo fue investigar los mecanismos fundamentales involucrados en la metástasis peritoneal del cáncer de ovario. Proponemos como hipótesis que las proteínas ERM (Ezrina/Radixina/Moesina), activadas por fosforilación (PERM), junto con el citoesqueleto de actina, desempeñan un rol estructural crucial en la proliferación y la formación de tumores en el líquido peritoneal. Con el objetivo de investigar la formación de esferoides en cáncer de ovario, utilizamos la línea celular de carcinoma de ovario SKOV3 y empleamos dos modelos in vitro: generación de esferoides en agar blando y formación de esferoides por agregación en suspensión. El primer método consistió en la generación de esferoides a partir de sucesivas divisiones de células embebidas en agarosa. En el segundo método, los esferoides se formaron por agregación en suspensión de las células sobre una base de agarosa. Los esferoides generados por ambos métodos fueron evaluados mediante inmunofluorescencia y microscopía de epifluorescencia y confocal. Para esclarecer el rol del citoesqueleto de actina en la formación de esferoides, se empleó citocalasina D (CD), la cual desestabiliza la organización de los filamentos de actina. El análisis cuantitativo reveló que el tratamiento con CD no tuvo un efecto significativo en la formación y compactación de los esferoides formados por agregación. No obstante, cuando las células fueron tratadas con CD y posteriormente incubadas en agarosa, no formaron esferoides en todos los tiempos ensayados. Para estudiar el rol de las proteínas ERM, generamos dos mutantes específicos de la proteína ezrina utilizando el sistema CRISPR-CAS9, denominados EZR6148 y EZR6059. La inserción de mutaciones en el gen de ezrina fue corroborada por secuenciación y la supresión de su expresión se verificó mediante WB. Ambas variantes EZR6148 y EZR6059 6 fueron incapaces de formar esferoides en agar blando en comparación con los controles SKOV3. Para evaluar la especificidad del fenotipo observado se reestableció la expresión de ezrina mediante transfección con un plásmido que expresa la versión completa de la proteína. El análisis de EZR6148 sobreexpresando ezrina evidenció formación de esferoides. Para evidenciar el rol estructural de ezrina, se llevaron a cabo ensayos de rescate del fenotipo de las células EZR6148: En primer lugar, se utilizó concanavalina A, lo cual permitió restablecer la capacidad de las células EZR6148 de formar esferoides en agar blando. En segundo lugar, las células fueron cultivadas en cantidades crecientes de agarosa, con lo cual se incrementó la rigidez del agar. Esto generó como resultado formación de esferoides por parte de las células EZR6148. En tercer lugar, los esferoides se formaron mediante el método de formación por agregación en suspensión, resultando en la formación exitosa de esferoides. Para dilucidar el rol de ezrina durante el desarrollo del cáncer de ovario se utilizó un modelo in vivo en ratones hembra nude N:NIH(S)-nu. Los ratones inyectados con células SKOV3 formaron tumores intraperitoneales al cabo de siete semanas, mientras que los inyectados con células EZR6148 evidenciaron una reducción estadísticamente significativa. La capacidad de formar tumores fue parcialmente restituida con la inyección de esferoides previamente formados con células EZR6148. Finalmente, con el objetivo de evaluar la expresión de PERM como posible biomarcador, se realizó un análisis inmunohistoquímico en secciones de tejido tumoral provenientes de pacientes con cáncer de ovario epitelial del HNC-UNC, Córdoba. Además, se analizó la expresión de E-cadherina, un marcador diagnóstico, y β-tubulina-III, un isotipo de βtubulina asociado a la resistencia a agentes quimioterapéuticos. En relación a PERM, se observó un incremento significativo de su expresión en tumoresrelacionados a un mayor grado histopatológico. Asimismo, se encontró una asociación significativa entre la expresión de PERM y la de E-cadherina en estos tumores. En cuanto a β-tubulina-III, se evidenció una asociación positiva con el estadio FIGO y con tratamientos quimioterapéuticos previos. A su vez, el análisis de la inmunomarcación de esferoides de fluido ascítico reveló una relación entre la presencia de PERM y E-cadherina con su respectivo tumor primario. 7 Los resultados obtenidos indican que el citoesqueleto de actina desempeña un rol fundamental en la formación de esferoides a partir de divisiones celulares, aunque no afecta la agregación y estabilidad de los esferoides en suspensión. Por otra parte, se demostró que ezrina es clave en la generación de esferoides en matrices blandas y en la generación de tumores intraperitoneales in vivo, en modelo murino. Estos resultados sugieren un rol clave de las proteínas ERM en el desarrollo de metástasis intraperitoneales en el cáncer de ovario epitelial. Por último, proponemos que la combinación de PERM, E-cadherina y β-tubulina-III, podría considerarse como un potencial biomarcador de malignidad en cáncer de ovario. En conclusión, el análisis de las proteínas ERM podría contribuir a mejorar el diagnóstico del cáncer de ovario epitelial y proporcionar una mejor prognosis para las pacientes.
Fil: Lujea, Noelia Carolina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales; Argentina.