Estudio de propiedades fisicoquímicas de matrices enzimáticas aplicables a biosensores amperométricos

• Autores: Capra, Raúl Horacio
• Año de publicación: 2006
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Baruzzi, Ana María; Strumia, Miriam Cristina; Masini de Repiso, Ana María de las Mercedes; Nores, Gustavo Alejandro; Solis, Velia Matilde
• Materia: Biosensores; Cinética enzimática; Electroquímica; Enzimas
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2006.
Fil: Capra, Raúl Horacio. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Generalidades Hace más de cuarenta años que el primer biosensor fue desarrollado por Clark y Lyions (1962) para determinar glucosa en sangre en forma continua durante un cirugía cardiovascular. En estos dispositivos se transforma la información química procedente de la interacción entre un sustrato (analito) y un receptor selectivo de éste (elemento de reconocimiento molecular), en una señal analítica suficientemente intensa para su cuantificación. Desde entonces se han desarrollado muchos electrodos de diseño muy variado incluyendo no sólo sensores electroquímicos, sino también transductores ópticos, piezoeléctricos y colorimétricos. Ahora bien, son relativamente pocos los biosensores electroquímicos capaces de funcionar confiablemente con muestras biológicas complejas como las de origen clínico. Esto se debe fundamentalmente a alteraciones funcionales o problemas de diseño en la estructura del sensor. Las primeras, generalmente son producidas por compuestos orgánicos, coloides y componentes celulares presentes en los fluidos biológicos. En este tipo de muestras existe una cantidad muy importante de sustancias con capacidad de interferir en la reacción específica; por ejemplo en los electrodos amperométricos enzimáticos, frecuentemente utilizados en la clínica, la presencia de compuestos electrooxidables en las muestras muchas veces afecta la especificidad del sensor. En cuanto al diseño, es necesario que el sensor tenga un amplio intervalo analítico útil para poder abarcar estados normales y patológicos sin necesidad de diluciones. Por otro lado la estabilidad también es muy importante no solo por razones de costo, sino también porque es deseable contar con ensayos en condiciones de operar en cualquier momento sin necesidad de armar un nuevo electrodo en cada oportudidad. Un electrodo amperométrico enzimático es aquél que asocia una enzima a un transductor electroquímico para detectar uno de los reactantes de la reacción catalizada. Cuando la enzima está en presencia del sustrato se obtiene una corriente eléctrica que puede ser correlacionada con la concentración de éste. La enzima se encuentra inmovilizada mantieniendo un estrecho contacto con el transductor electroquímico. Existen distintos métodos para inmovilizar la enzima que se discutirán en el capítulo IV. Entre estos, el entrecruzamiento covalente con reactivos bifuncionales (también llamado reticulado) se emplea frecuentemente por la gran estabilidad enzimática que se logra y la facilidad de preparación; además la matriz puede ser colocada entre dos membranassemipermeables (como policarbonato, acetato de celulosa, cuprofan, etc.) formando un "sándwich" que puede ser manipulado con facilidad (Magner, E. 1998). Una de las proteínas soporte utilizada con mayor frecuencia para el entrecruzamiento en este tipo de sensores es la albúmina sérica bobina (D'Orazio, 2003) Además de la albúmina, son varias las matrices usadas para inmovilizar enzimas por entrecruzamiento. Generalmente son polímeros de origen natural o sintético, con grupos funcionales reactivos, que posteriormente son usados como puntos de anclaje para la unión covalente de la enzima. Algunos de ellos son agarosa, almidón, quitosán, mucina, carbopol, dextranos, etc. Las propiedades naturales de la mucina, sobre todo su capacidad de actuar como barrera controlando la difusión de determinados solutos (Peppas, N.A. 1984) fue lo que nos llevó a considerarla como elemento soporte del reticulado. Como base para comparación se tomó un biosensor de estructura similar, pero que utiliza albúmina como proteína soporte para el entrecruzamiento de la enzima con glutaraldehido (Reddy, S. 1997) El tipo de reacción de polimerización (entrecruzamiento) que se utiliza para atrapar la enzima afecta claramente las propiedades fisicoquímicas de la matriz formada (Gibbson, 1999). Un aumento en la densidad de entrecruzamiento produce polímeros más rígidos y quebradizos, con menor capacidad de incluir moléculas de agua afectando los fenómenos de difusión a través de esa matriz. En esta tesis se eligió y desarrolló un modelo de biosensor amperométrico enzimático para medición de oxalato en orina. La enzima, oxalato oxidasa, fue inmovilizada por entrecruzamiento con glutaraldehido en un electrodo tipo "sándwich" utilizando mucina como proteína soporte en lugar de albúmina. Se estudiaron propiedades fisicoquímicas de la matriz enzimática con el fin de optimizarla y predecir de qué manera el rendimiento del electrodo se verá afectado por un cambio o modificación en alguno de sus componentes. Por otro lado el tipo de proteína utilizada en el entrecruzamiento puede interactuar con el compuesto de interés analítico regulando su interacción con la enzima. Estas propiedades fueron evaluadas a través de mediciones de índices de hinchamiento, reología, impedancia electroquímica y difusión bajo diferentes condiciones experimentales en especial de composición y pH. Estas técnicas se utilizan habitualmente en el campo de la Liberación Controlada de Fármacos para análisis de interacciones Mucina/Polímero Mucoadhesivo y su consecuencia en el transporte de drogas (Craig, D. Q. 1995). El fundamento y la utilidad de estas metodologías se detallan en los capítulos VII, VIII y IX.
Fil: Capra, Raúl Horacio. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.