Mecanismo de funcionamiento de ATPasas transportadoras de Cu+. Aspectos cinéticos y termodinámicos

• Autores: Placenti, María Agueda
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: González-Lebrero, Rodolfo M.; Lores Arnaiz, Silvia; Wetzler, Diana; Raimunda, Daniel
• Materia: P-ATPasas; Cinética; Termodinámica; Cu+; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Placenti, María Agueda. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Las P-ATPasas constituyen una gran familia de proteínas que acoplan la energía química procedente de la hidrólisis del ATP al transporte de solutos a través de membranas biológicas. Dentro de esta familia, las P1B-ATPasas se encargan del transporte de iones de metales de transición, siendo las ATPasas transportadoras de cobre las más conservadas y ampliamente distribuidas de esta subfamilia.\nEl modelo postulado para describir el mecanismo de funcionamiento de las P-ATPasas fue desarrollado principalmente a partir de estudios llevados a cabo sobre los miembros más conocidos de la familia como Na+,K+-ATPasa y SERCA. Sin embargo, diversos autores plantean que las Cu+-ATPasas poseerían un mecanismo de reacción distinto a este, aunque las evidencias funcionales y estructurales en las que se basan son dispares, lo que dificulta su integración en pos de conclusiones de carácter general. Podemos señalar como causas de este problema: la escasa sistematización en el estudio de las distintas propiedades caracterizadas y la variabilidad de condiciones experimentales empleadas en los diversos estudios.\nEl presente trabajo de tesis tiene como objetivo el estudio sistemático de la funcionalidad de las ATPasas transportadoras de Cu? y el planteo de un modelo cinético de su mecanismo de funcionamiento, empleando para ello a aquella proveniente de Legionella pneumophila (LpCopA).\nPara alcanzar el objetivo, LpCopA se expresó en E. coli mediante el uso de un plásmido inducible y fue purificada mediante: solubilización por el agregado de detergentes, cromatografía de afinidad (Ni-NTA) y cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-50). Una vez obtenida la proteína se evaluó su funcionalidad, permitiendo enmarcarla dentro de las P-ATPasas y Cu+-ATPasas. En particular, se determinó su velocidad de hidrólisis de ATP y su fosforilación, evaluando la respuesta al Cu?. Se evaluaron los efectos del Mg2? y del vanadato sobre la velocidad de hidrólisis de ATP, descritos como activador esencial y como inhibidor de las enzimas de la familia, respectivamente. Adicionalmente, se evaluó el efecto de Ag+, un ión reportado como activador en otras Cu+-ATPasas, sobre la actividad de la enzima. Posteriormente, se caracterizaron los efectos que producen sobre el funcionamiento de LpCopA distintos componentes del medio de reacción. Se observó que, si bien la presencia de agentes reductores es necesaria para mantener la totalidad de cobre en su estado de oxidación Cu+, la cisteína posee un efecto activador adicional posiblemente debido a una interacción directa con la enzima. Se halló que la actividad de LpCopA está fuertemente influenciada por la concentración de sales y que este efecto sería independiente de la naturaleza química de los cationes (K+ y Na+). Finalmente, se observó que la actividad de Cu+-ATPasa de LpCopA se ve fuertemente modificada por su entorno lipídico, evidenciándose una fase activadora a las menores relaciones de anfifilo/proteína o fracciones molares de asolectina (Xasolectina) ensayadas, mientras que a mayores valores de estos se observó una disminución. El efecto de Xasolectina sobre la actividad pudo ser descrito por un modelo desarrollado para explicar la activación por fosfolípidos en otras P-ATPasas. Se evaluó el efecto del pH sobre la actividad Cu+-ATPasa de LpCopA, observándose un comportamiento bifásico con un máximo a pH 6.6. Se concluyó que este no se debería a eventos de protonación en los componentes del medio de reacción necesarios para el funcionamiento de la enzima como la cisteína o el ATP y sus complejos con Mg2+, sino que sería el resultado de protonaciones/desprotonaciones sobre residuos de la proteína los cuales afectan la velocidad máxima de la reacción. En base al modelo fenomenológico planteado por Hill se arribó a la conclusión de que serían necesarias por lo menos 2 protonaciones, en un proceso que sería cooperativo, para alcanzar la especie activa, mientras que por lo menos otras 3 protonaciones, también posiblemente cooperativas, inactivarían a la proteína.\nAdicionalmetne, se estudió el efecto de la temperatura sobre la actividad Cu?-ATPasa de LpCopA, observándose un aumento hasta alcanzar un máximo a la temperatura óptima de funcionamiento (Top = 37°C), disminuyendo a temperaturas mayores. La dependencia de la actividad con la temperatura fue analizada utilizando tanto la teoría formulada por Kramers para la teoría del estado de transición como el llamado ?modelo en equilibrio?, que plantea un equilibrio entre especies activas e inactivas en condiciones no desnaturalizantes. Este análisis nos permitió obtener las magnitudes de los parámetros tanto de activación como aquellos termodinámicos del equilibrio que caracterizan el sistema, arribando a la conclusión de que la reacción de catálisis de ATP se encuentra impulsada entálpicamente, y que a Top una parte significativa de la enzima no se encontraría activa, siendo el equilibrio entre las especies muy sensible a la temperatura. Finalmente, se estudió el efecto de los ligandos naturales (ATP y Cu?) de LpCopA sobre su actividad Cu?-ATPasa en condiciones de estado estacionario. Los resultados experimentales obtenidos fueron analizados mediante el ajuste de funciones empíricas, arribando a una función general mínima que permitió reproducir cualitativa y cuantitativamente la dependencia de la actividad de la enzima con la concentración de ambos sustratos de manera simultánea. A partir de la información obtenida del estudio de dicha ecuación, así como la obtenida de otros resultados experimentales mostrados a lo largo de la tesis, junto a la disponible en bibliografía para las P-ATPasas, se desarrolló un modelo mínimo que reproduce el comportamiento experimental observado y que daría cuenta del mecanismo de funcionamiento de la enzima. Este modelo presenta algunas características comunes de los modelos de funcionamiento de otras P-ATPasas, como son la formación de intermediarios fosforilados y la unión de ATP a dos conformaciones distintas de la enzima. Una particularidad del modelo de reacción propuesto es la unión secuencial de dos iones Cu+ con afinidades diferentes.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Bioquímicas