Síndrome de Ehlers-Danlos en pacientes con hiperplasia suprarrenal congénita portadores de la deleción del gen CYP21A2

• Autores: Notaristefano, Guillermo Jorge
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Marino, Roxana; Belgorosky, Alicia; Ropelato, Gabriela; WIlda, Maximiliano; Lopez, Ariel Pablo
• Materia: Tenascina; Síndrome de Ehlers-Danlos; Hiperplasia suprarrenal congénita; CYP21A2; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Context: The contiguous gene deletion syndrome, CAH-X, was reported in a 15,6% of congenital adrenal hyperplasia (CAH) (Lao Q et al, 2019) and a 62,8% of CYP21A2 deletion carrier patients with TNXA/TNXB chimera (Gao Y et al, 2020). This results in deletions of CYP21A2 gene (30-kb deletion), encoding 21-hydroxylase necessary for cortisol biosynthesis, and contiguous deletion that extended into TNXB gene, which encodes the extracellular matrix glycoprotein tenascin-X (TNX). There are three TNXA/TNXB chimeras or gene conversions identified that differ in the junction site. CAH-X chimera 1 (CH-1) has TNXB exons 35?44 replaced with TNXA pseudogene and is characterized by the presence of the c.11435_11524+30del variant, CAH-X chimera 2 (CH-2) has TNXB exons 40?44 replaced with TNXA and is characterized by the TNXA derived c.12174C>G variant (Morissette R et al, 2015), and CAH-X chimera 3 (CH-3) has TNXB exons 41?44 replaced by TNXA and is characterized by the presence of three TNXA derived missense variants (Chen W et al, 2016). These chimeras results in TNXB haploinsufficiency or dominant negative effect and an Ehlers-Danlos Syndrome (EDS) phenotype. CAH-X syndrome has been described in monoallelic and biallelic forms (Chen W et al, 2016). Patients with known CAH-X syndrome should have a clinical evaluation to follow-up and prevent some severe events, as cardiac outcomes.\nObjective: The aim of this study was to develop a molecular strategy to analyze copy number variations and genetic status of TNXB gene in cohort of CAH patients carriers of CYP21A2 deletion to estimate the frequency of TNXB alterations in our population and perform clinical evaluation for EDS.\nMaterials and methods: A total of 66 unrelated CAH patients (44 females, 22 males, aged 4 days-36 years) carriers of CYP21A2 gene deletion (73 alleles), 43 parents and 8 siblings were screened for TNXB defects. All these 117 subjects were analyzed for CH-1 by MLPA technique (SALSA P050-CAH version C1, MRC Holland) evidenced by a 120 bp deletion in TNXB exon 35, which derives from TNXA pseudogene. We designed a PCR using a mixed oligonucleotide strategy to amplify a fragment of 5010 bp, considering pseudogene TNXA interference, and then all subjects were screened for other TNXB alterations related to CH-2 and CH-3 by exon 40, 41 and 43 Sanger sequencing. We performed clinical evaluation of connective tissue dysplasia associated with EDS in 17 unrelated probands, 3 CAH siblings and 13 parents that were available and in whom a TNXB alteration was found. All patients were evaluated for joint and skin abnormalities and always by the same examiner using major and minor criteria for the diagnosis of classical-like and hypermobile EDS (Malfait et al, 2017). The Beighton 9-point scoring system was used to evaluate generalized joint hypermobility (score ? 6 for pre-pubertal children and adolescents, ? 5 for pubertal men and women up to the age of 50 and ? 4 for those > 50 years of age). Structural cardiac evaluation was also performed by doppler color echocardiography.\nResults: A molecular strategy to assess copy number variations and genetic status of TNXB was developed. TNXA/TNXB CH-1 was found in 30/73 (41%) non-related alleles carriers of CYP21A2 gene deletion. In addition, CH-2 and CH-3 were found in 21/73 (29%) and 1/73 (1.5%) alleles, respectively. This means that 71% of alleles were found to carry a contiguous gene deletion that extended into TNXB gene. Out of 66 non-related patients that were homozygous or heterozygous for CYP21A2 gene deletion and were evaluated in this study for copy number variations of TNXB gene, the monoallelic form was found in 43 patients (65%), while 4 patients were found to have a biallelic form (6%, 2 were homozygous for CH-1 and 2 were compound heterozygous for CH-1 and CH-2). All patients with biallelic form had generalized joint hypermobility, hypermobility of small joints, severe skin hyperextensibility and easy bruising, and they had clinical features of EDS with more severe phenotype than monoallelic form, while cardiac abnormalities were found in both forms.\nConclusions: A high frequency of TNXB alterations was found in CYP21A2 deletion carrier alleles in our population. MLPA, PCR and Sanger sequencing techniques resulted effective to characterize TNXB deletion. We found clinical manifestations of Ehlers-Danlos syndrome in subjects with biallelic and monollelic forms but accurate genotype-phenotype correlation remains to be elucidated in this cohort. Based on the high frequency of TNXB alterations in CYP21A2 deletion carrier alleles found, we recommend to evaluate TNXB status in these patients, warranting assessment and follow-up of connective tissue dysplasia including cardiologic alterations in positive cases. It would be important to expand the number of patients with cardiological evaluation in order to determine the incidence of structural and functional abnormalities in this cohort. Lastly, we found significant evidence in order to establish this molecular strategy in our hospital to evaluate congenital adrenal hyperplasia patient carriers of CYP21A2 gene deletion.
Fil: Notaristefano, Guillermo Jorge. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Contexto: El síndrome de deleción de genes contiguos (HSC-X) fue reportado en el 15,6% de los individuos con hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) (Lao Q et al, 2019) y en el 62,8% de los pacientes con HSC y portadores de la deleción completa del gen CYP21A2 que presentaban quimeras TNXA/TNXB (Gao Y et al, 2020). Estos individuos presentan una deleción de 30-kb que involucra al gen CYP21A2, que codifica para la enzima 21-hidroxilasa que interviene en la biosíntesis del cortisol, y al gen contiguo TNXB, que codifica para una glicoproteína de la matriz extracelular llamada tenascina (TNX). Como resultado de una recombinación homóloga desigual pueden generarse quimeras (CH) TNXA/TNXB, las cuales difieren en su punto de unión. La quimera TNXA/TNXB CH-1 se caracteriza por la presencia de una deleción nonsense de 120 pb (c.11435_11524+30del), proveniente del pseudogen TNXA, situada en una región comprendida entre el exón 35 y el intrón 35. En esta quimera, el segmento génico comprendido entre los exones 35 y 44 de TNXB se encuentra reemplazado por el pseudogen TNXA. La quimera TNXA/TNXB CH-2 está determinada por la presencia de una variante missense, c.12174C>G (p.Cys4058Trp), en el exón 40, también derivada de TNXA; en ésta se encuentra reemplazada la región comprendida entre los exones 40 y 44 de TNXB por su región homóloga de TNXA (Morissette R et al, 2015). En la quimera TNXA/TNXB CH-3 se encuentra reemplazado el segmento comprendido entre los exones 41 y 44 de TNXB por su región homóloga de TNXA; y se caracteriza por presentar tres variantes missense (Chen W et al, 2016). Estas quimeras pueden originar haploinsuficiencia de TNXB, en el caso de CH-1, o generar un efecto dominante negativo, en el caso de CH-2 y CH-3, ocasionando un fenotipo compatible con el síndrome de Ehlers-Danlos (SED), en ambas situaciones. Además, estas quimeras pueden aparecer en forma monoalélica o bialélica en el contexto de HSC-X (Chen W et al, 2016). Por ello, en los individuos con HSC-X se debería realizar una correcta evaluación clínica y garantizar su seguimiento para prevenir eventos graves, como son aquellos cardiovasculares.\nObjetivos: Desarrollar una estrategia de estudio molecular de las alteraciones en el gen TNXB, mediante la búsqueda de quimeras TNXA/TNXB en pacientes con HSC por déficit de 21-hidroxilasa y portadores de la deleción completa de CYP21A2. Determinar la frecuencia de las quimeras, en forma monoalélica y bialélica, en dicha cohorte. Evaluar fenotipo asociado a SED en dichos individuos.\nMateriales y métodos: Se evaluaron alteraciones en el gen TNXB en 66 individuos no relacionados (44 mujeres, 22 hombres, con rango etario 4 días ? 36 años) con HSC por deficiencia de 21-hidroxilasa y portadores de la deleción completa de CYP21A2 (lo que corresponde a 73 alelos), 43 padres y/o madres y 8 hermanos, a través del uso de MLPA (SALSA P050-CAH versión C1, MRC Holland) para detectar la CH-1. Luego se utilizó una PCR convencional puesta a punto en este trabajo, con una estrategia de cebadores mixtos, donde se amplifica un fragmento de 5010 pb, para luego utilizar secuenciación de Sanger para la búsqueda de las variantes asociadas a CH-2 y CH-3, en los exones 40, y 41 y 43, respectivamente. La evaluación clínica de la displasia del tejido conectivo asociada a SED se realizó en 17 individuos no relacionados, 3 hermanos con HSC y 13 progenitores que tenían alteraciones en TNXB. Para todos estos individuos, el mismo examinador realizó el examen físico y la revisión de antecedentes médicos y familiares en busca de manifestaciones clínicas relacionadas a SED del subtipo símil clásico y subtipo hipermóvil, usando criterios mayores y menores (Malfait F et al, 2017). El sistema de puntación de 9 puntos de Beighton se usó para evaluar hipermovilidad articular generalizada (puntaje ? 6 para niños prepuberales y adolescentes, ? 5 para hombres en pubertad y mujeres hasta la edad de 50 años, ? 4 para hombres y mujeres mayores a 50 años). Se realizó la evaluación por el Servicio de Cardiología para el estudio de anomalías estructurales y funcionales mediante ecocardiograma.\nResultados: A partir de la estrategia molecular establecida se encontró entre los alelos no relacionados portadores de la deleción de CYP21A2, que el 41% (30/73) presentaba CH-1, mientras que el 29% (21/73) y 1.5% (1/73) contenía CH-2 y CH-3, respectivamente. Esto significa que el 71% de los alelos tenía simultáneamente una deleción contigua en TNXB. Entre los 66 individuos no relacionados con HSC y con deleción de CYP21A2 en forma heterocigota u homocigota, se encontró que 43 pacientes (65%) presentaban forma monoalélica de la quimera, mientras que 4 pacientes tenían forma bialélica (6%, 2 individuos eran homocigotas y 2 individuos eran heterocigotas compuestos para CH-1 y CH-2). Todos los pacientes con forma bialélica presentaron hipermovilidad articular generalizada, hipermovilidad en pequeñas articulaciones, hiperextensibilidad cutánea, facilitad de aparición de hematomas, y estos presentaron características clínicas con mayor grado de severidad que la forma monoalélica; en ambas formas se encontraron alteraciones cardíacas.\nConclusiones: Fue posible establecer una estrategia de estudio molecular del gen TNXB, en individuos con diagnóstico previo de HSC por déficit de la enzima 21-hidroxilasa y portadores de la deleción completa del gen CYP21A2, a través de la presencia de quimeras TNXA/TNXB, en forma monoalélica o bialélica. Se utilizaron las técnicas de MLPA, PCR punto final y posterior secuenciación de Sanger, las cuales demostraron ser útiles y efectivas para la búsqueda de quimeras y su caracterización molecular. Este desarrollo nos permitió determinar una alta frecuencia de las quimeras en los alelos portadores de la deleción de CYP21A2 en dicha cohorte, la cual contó con un número significativo de individuos. En cuanto a la evaluación clínica de síndrome de Ehlers-Danlos, se observó fenotipo compatible con displasia del tejido conectivo en un porcentaje considerable de los individuos con alteración en TNXB, encontrándose mayor severidad clínica en individuos con forma bialélica (donde ambos alelos están afectados). Una limitante de nuestro estudio es que se debería completar la evaluación clínica de los individuos restantes, para alcanzar un mayor número de casos y establecer una correlación robusta entre el genotipo y el fenotipo. De a acuerdo a la frecuencia de las quimeras TNXA/TNXB hallada, se recomienda evaluar su presencia en individuos con hiperplasia suprarrenal congénita y portadores de la deleción completa de CYP21A2, utilizando el protocolo establecido, con fines diagnósticos de HSC-X y posterior seguimiento de las alteraciones clínicas causadas por dicha displasia incluyendo los trastornos cardíacos, que pueden conducir a eventos de gravedad.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica