Una aproximación a la conformación proteica a través de la fotomarcación de superficies acoplada a resonancia magnética nuclear

• Autores: Bernar, Evangelina Marisel
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Gómez, Gabriela Elena; Delfino, José María; Alonso, Leonardo; Binolfi, Andres; Moglioni, Albertina
• Materia: Fotomarcado; RMN; DZN; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

The solvent accessible surface area (SASA) in proteins is a geometric parameter of\ncentral importance in the thermodynamics of folding and interaction. The use of\ndiazirine (DZN) as a mimetic probe of the aqueous solvent allowed us to estimate the\nmagnitude and nature of SASA, by generating stable methylated products. The novel\nuse of NMR as an analytical technique coupled with DZN labeling yields site-specific\ninformation without the need to fragment the sample, due to the possibility of\nunambiguously assigning and identifying the labeled sites. Using E. coli thioredoxin\n(EcTRX) as a model protein for its labeling with DZN, we observed that the dominant\nmodification phenomenon involves the sparse methylation of amino acid side chains,\na fact supported by the enrichment of the aliphatic region observed in the 1H NMR\nspectra. In the unfolded state (8M urea), EcTRX shows a generalized higher\nmethylation profile, consistent with the extensive solvent exposure of the polypeptide\nchain.\n1H, 15N HSQC spectra reveal the differential impact of the methylation reaction on\nbackbone amide bond environments. From the quantitative analysis of the variation\nin the intensity associated with each cross peak (N-H) of the labeled samples with\nrespect to the control sample, it was possible to obtain a direct measure of the\ndegree of modification of each amino acid. In parallel, the 1H, 13C HSQC spectra of\nEcTRX labeled with DZN show new spots caused by the appearance of methyl\ngroups exposed to water. The relative intensity of the cross peaks corresponding to\nCH? allowed to determine the degree of methylation at the level of individual amino\nacids. In addition, the analysis of the signals of CH?, CH? and CH? show details of\nthe methylation of the side chain, observing the following trend:\nCH?>CH?>CH?>CH?. Thus, a fully consistent pattern emerges from both the HN\nand HC regions.\nThe analysis of results obtained in the context of the three-dimensional structure of\nEcTRX made it possible to define that the amino acids that show to the greatest\nextent the impact of methylation are part of the ?2 helix and secondary structure\nmotifs spatially close to that helix: amino acids that are components of the ?2, ?4\nstrands and the loop connecting the ?5 strand with the ?4 helix. The significance of\nthis finding lies in the fact that, precisely, this area embodies a main triad of cavities\nin EcTRX, capable of lodging the DZN reagent (host-guest interaction). By their\nnature, these internal surface elements are preferential targets for the methylation\nreaction.\nAs an overall conclusion, we show here that methylene carbene modification\ncoupled to NMR detection offers a rich and useful new source of information\nfor the mapping of a folded polypeptide, the study of conformational changes,\nand the identification of protein interaction surfaces.
Fil: Bernar, Evangelina Marisel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
El área accesible al solvente (SASA) de las proteínas es un parámetro geométrico de gran importancia en la termodinámica de los procesos de plegado e interacción.\nDiazirina (DZN) -como sonda mimética del solvente acuoso- permite estimar la magnitud y la naturaleza del SASA, generando productos metilados estables. La novedad del empleo de RMN como técnica analítica acoplada a la metilación permitió obtener información sitio específica sin necesidad de fragmentación, gracias a la posibilidad de asignar e identificar sin ambigüedades los sitios de marcación. El fenómeno dominante observado en tiorredoxina de E. coli (EcTRX) involucra la metilación esporádica de las cadenas laterales de los aminoácidos, hecho observado a través del enriquecimiento de la región alifática observado en los espectros 1H-RMN. En el estado desplegado (urea 8M), EcTRX muestra un perfil de metilación mayor, consistente con una amplia exposición al solvente de la cadena polipeptídica.\nLos espectros 1H, 15N HSQC revelan el impacto diferencial de la reacción de\nmetilación sobre los entornos de las uniones amida de la cadena principal. A partir\ndel análisis cuantitativo de la variación en la intensidad asociada a cada cross peak\n(N-H) de las muestras marcadas respecto de la muestra control, fue posible obtener\nuna medida directa del grado de modificación de cada aminoácido. Paralelamente,\nlos espectros de 1H, 13C HSQC de EcTRX marcada con DZN muestran nuevos\npeaks originados por la aparición de grupos metilos expuestos al agua. La intensidad\nrelativa de los cross peaks correspondiente a CH? permitió determinar el grado de\nmetilación a nivel de aminoácidos individuales. Además, el análisis de las señales de\nlos CH?, CH? y CH? muestran detalles de la metilación de la cadena lateral,\nobservándose la siguiente tendencia: CH?>CH?>CH?>CH?. De este modo, emerge\nun patrón completamente coherente de las regiones más modificadas.\nEl análisis de los resultados obtenidos en el contexto de la estructura tridimensional\nde EcTRX permitió definir que los aminoácidos que muestran en mayor medida el\nimpacto de la metilación forman parte de la hélice ?2 y de motivos de estructura\nsecundaria espacialmente próximos a dicha hélice: aminoácidos componentes de la\nhebras ?2, ?4 y el loop que conecta la hebra ?5 con la hélice ?4. El significado de\neste hallazgo radica en que, precisamente, esta zona limita una triada principal de\ncavidades en EcTRX, capaz de alojar el reactivo DZN (interacción host-guest). Por\nsu naturaleza, estos elementos de superficie internos resultan blancos preferenciales\nde la reacción de metilación.\nComo conclusión general, demostramos que la modificación con metilén\ncarbeno acoplada a la detección por RMN ofrece una nueva fuente de\ninformación útil y rica para el mapeo de la topología del polipéptido plegado, el\nestudio de cambios conformacionales y la identificación de superficies de\ninteracción en proteínas.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Bioquímicas