Estudio del rol del dominio cápside de la poliproteína Gag en el ensamblado del virus de la inmunodeficiencia de felinos

• Autores: Ovejero, César Antonio
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Affranchino, José Luis; Campos, Rodolfo H.; González, Silvia Adriana; Turk, Gabriela; Cavallaro, Lucia; Jaworski, Juan Pablo
• Materia: Virus de la inmunodeficiencia de felinos; Virus de la inmunodeficiencia de simios; Proteína cápside; Ensamblado viral; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Lentiviruses assemble at the plasma membrane of infected cells as the result of Gag\npolyprotein multimerization into spherical particles that bud into the extracellular\nmedium. We have previously shown for both feline immunodeficiency virus (FIV)\nand simian immunodeficiency virus (SIV) that the capsid domain (CA) of the Gag\nprecursor plays two roles during viral replication. As a domain of Gag, it participates\nin the Gag-Gag interactions that drive viral particle assembly and, as a mature\nprotein of infectious virions, it forms the viral core that preserves the integrity of the\ncomplex between the genomic RNA and the nucleocapsid protein (NC). To establish\nthe structural and functional relationship between the CA domains of FIV and SIV\nwe constructed chimeric FIV gag genes in which the CA domain was partially or\ncompletely replaced by that of SIV. We found that FIV Gag proteins carrying the\ncomplete CA together with SP1 and the first eight amino acids of the NC, the aminoterminal\ndomain of the CA (CA-NTD) or the carboxyl region of this protein (CA-CTD)\nare unable to assemble into viral particles. However, all these assembly-deficient\nchimeric Gag proteins are rescued into extracellular particles when co-expressed\nwith the wild-type SIV Gag protein. Importantly, our laboratory has previously\ndemonstrated that SIV Gag proteins carrying the CA-p1-NC(amino acids 1-9) region\nof FIV or the CA-CTD of this feline virus are assembly competent. Taken together,\nour studies demonstrate that although the FIV and SIV CA proteins exhibit a similar\norganization (amino and carboxyl domains with helical structure linked by a flexible\nregion) and 52% similarity at the amino acid level, the functional exchange of CA\ndomains between these two lentiviruses is dependent on the recipient Gag protein.\nOur phenotypic characterization of chimeric Gag proteins derived from FIV and SIV\nprovides relevant information regarding the structural requirements for lentiviral\nassembly.\nImmature lentiviral virions are composed of a lattice of Gag hexamers, which is\nmaintained by inter- and intrahexameric interactions of the CA-NTD and by\ninterhexameric associations of the CA-CTD. Notably, the viral core consists of CA\nprotein hexamers in which the CA-CTD also establishes interhexameric interactions\ninvolving ?-helix 9. In HIV-1, it has been proposed that the W184/M185 motif of the\nCA-CTD helix 9 is important for viral morphogenesis. The FIV CA exhibits at\nequivalent positions the amino acids YL whereas, in another lentivirus, equine\ninfectious anemia virus (EIAV), the motif is FL. We therefore decided to introduce a\nseries of amino acid substitutions in the Y176/L177 motif of the FIV CA to investigate\ntheir effect on Gag assembly, CA oligomerization (which is essential for viral core\nformation), production of mature virions and viral infection. The results obtained\ndemonstrate that the sole substitution of alanine for Y176 or L177 in the FIV CA is\nsufficient to suppress both Gag multimerization into extracellular viral particles and\nin vitro Gag assembly. Furthermore, the recombinant CA protein carrying the Y176A\nmutation is unable to oligomerize in vitro. Furthermore, while the Y176W mutation\ninhibits particle formation by 80%, the amino acid substitutions Y176F, L177M and\nY176W/L177M reduce Gag assembly by 50% with respect to wild-type Gag. The\nY176F and Y176W/L177M mutations were designed to convert the original YL motif\nof the FIV CA into the FL or WM motifs, which are found at equivalent positions in\nthe CA proteins of EIAV and HIV-1, respectively. Notably, the presence in the FIV\nCA of the WM or FL motifs allows the production of mature virions that replicate in\nfeline cells. Our results demonstrate that in FIV the YL motif of the CA ?-helix 9 is\nessential for both Gag multimerization into virions and oligomerization of the mature\nCA protein. Moreover, we demonstrate the existence of functionally equivalent\nmotifs in the CA-CTD of FIV, EIAV and HIV-1.
Fil: Ovejero, César Antonio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Los lentivirus se ensamblan en la membrana plasmática de las células infectadas\ncomo resultado de la multimerización de la poliproteína Gag en partículas esféricas\nque brotan al medio extracelular. Hemos demostrado previamente tanto para el\nvirus de la inmunodeficiencia de felinos (FIV) como para el de simios (SIV) que el\ndominio cápside (CA) del precursor Gag cumple dos funciones en la replicación\nviral. Como dominio de Gag, participa de las interacciones Gag-Gag que conducen\nal ensamblado de partículas virales y, como proteína madura de los viriones\ninfecciosos, forma el core viral que preserva la integridad del complejo entre el ARN\ngenómico y la proteína nucleocápside (NC). Con el objeto de establecer la relación\nestructural y funcional entre los dominios CA de FIV y SIV construimos genes gag\nquiméricos de FIV en los cuales el dominio CA fue reemplazado parcial o totalmente\npor el de SIV. Encontramos que las proteínas Gag de FIV llevando la CA completa\njunto con SP1 y los primeros ocho aminoácidos de la NC, el dominio amino de la\nCA (CA-NTD) o la región carboxilo de esta proteína (CA-CTD) son incapaces de\nensamblarse en partículas virales. Sin embargo, todas estas proteínas Gag\nquiméricas, deficientes en ensamblado, son rescatadas en partículas extracelulares\nal ser coexpresadas con la proteína Gag salvaje de SIV. Cabe destacar que\npreviamente nuestro laboratorio ha demostrado que proteínas Gag de SIV llevando\nla región CA-p1-NC(aminoácidos 1-9) de FIV o el CA-CTD del virus felino son\ncompetentes en ensamblado. En conjunto, nuestros estudios demuestran que a\npesar de que las CA de FIV y de SIV exhiben una organización similar (dominios\namino y carboxilo con estructura helicoidal unidos por una región flexible) y un 52%\nde similitud a nivel aminoacídico, el intercambio funcional de dominios de la CA\nentre estos dos lentivirus es dependiente de la proteína Gag receptora. La\ncaracterización fenotípica que hemos realizado de proteínas Gag quiméricas\nderivadas de FIV y de SIV provee información relevante respecto de los\nrequerimientos estructurales para el ensamblado lentiviral.\nLos viriones inmaduros de los lentivirus se hallan formados por una red hexamérica\nde moléculas de Gag, la cual está mantenida por interacciones inter e\nintrahexaméricas del CA-NTD y por asociaciones interhexaméricas del CA-CTD.\nCabe destacar que el core viral se halla formado por hexámeros de la proteína CA\nen los cuales el CA-CTD también establece interacciones interhexaméricas que\ninvolucran a la ?-hélice 9. En HIV-1, se ha propuesto que el motivo W184/M185 de\nla hélice 9 del CA-CTD es importante para la morfogénesis viral. La CA de FIV\nexhibe en posiciones equivalentes los aminoácidos YL mientras que, en otro\nlentivirus, el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV), el motivo es FL. Decidimos\nentonces introducir una serie de sustituciones aminoacídicas en el motivo\nY176/L177 de la CA de FIV para luego investigar su efecto sobre el ensamblado de\nGag, la oligomerización de la CA (la cual es esencial para la formación del core\nviral), la producción de viriones maduros y la infección viral. Los resultados\nobtenidos demuestran que el solo hecho de reemplazar la Y176 o la L177 de la CA\nde FIV por alanina es suficiente para suprimir tanto la multimerización de Gag en\npartículas virales extracelulares como el ensamblado in vitro de Gag. Además, la\nproteína CA recombinante llevando la mutación Y176A es incapaz de oligomerizar\nin vitro. Por otro lado, mientras la mutación Y176W inhibe en un 80% la formación\nde partículas, las sustituciones aminoacídicas Y176F, L177M y Y176W/L177M\nreducen el ensamblado de Gag en un 50% respecto de la producción de partículas\nextracelulares por la proteína Gag salvaje. Las mutaciones Y176F y Y176W/L177M\nfueron diseñadas para convertir al motivo YL original de la CA de FIV en los motivos\nFL o WM, los cuales se hallan en posiciones equivalentes en las proteínas CA de\nEIAV y HIV-1, respectivamente. Cabe destacar que la presencia en la CA de FIV\nde los motivos WM o FL no solo permite la producción de viriones maduros, sino\nque éstos son capaces de replicarse en células felinas. Nuestros resultados\ndemuestran que, en FIV, el motivo YL de la ?-hélice 9 de la CA es esencial tanto\npara la multimerización de Gag en viriones como para la oligomerización de la\nproteína CA madura. Además, demostramos que existen motivos funcionalmente\nequivalentes en el CA-CTD de FIV, EIAV y HIV-1.
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas