Desarrollo y optimización de la técnica de amplificación isotérmica mediada por loops (LAMP) para la elaboración de un kit diagnóstico de leptospirosis animal : Lepto-LAMP

• Autores: Hamer, Micaela
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Brihuega, Bibiana F.; Radice, Marcela; Martínez, Mara L.; Power, Pablo; Rumi, Valeria; Sauka, Diego
• Materia: Leptospirosis; Leptospira; LAMP; Calceína; Azul de hidroxinaftol; PCR; Hámster; Sensibilidad; Especificidad; Leptospirosis; Leptospira; LAMP; Calcein; Hydroxynaphthol blue; PCR; Hamster; Sensitivity; Specificity
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Leptospirosis is considered one of the most widespread zoonotic diseases in the world. In Argentina, it is endemic, with outbreaks occurring mainly during periods of abundant precipitation. Leptospira spp. is the second most important abortifacient pathogen in livestock production, responsible for the loss of millions of dollars in the beef and dairy industry in the Pampas region. In addition to the economic impact on animal industries, this zoonosis represents a risk to humans who are in constant contact with infected animals, whether domestic or wild. For these reasons, it is crucial to have diagnostic tools that allow simple and effective detection of the agent, in order to implement necessary measures to prevent spread of the pathogen and mitigate economic and health consequences.\nThe aim of this PhD thesis was to develop a method for detecting leptospiral DNA based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique, designed for application in low-complexity laboratories, using national supplies and easy handling: Lepto-LAMP.\nInitially, two DNA extraction methods were evaluated, with Chelex®100 resin chosen for serum and animal urine samples due to its high yield, despite not requiring an additional purification step. On the other hand, the PURO Genomic DNA® kit was selected for samples of animal organs, as it allowed for purer DNA extraction than the resin.\nDuring the design of the LAMP reaction for the detection of leptospiral DNA, five possible indicators for direct visual result reading were tested: pH indicators, malachite green, SYBR Safe®, hydroxynaphthol blue, and calcein; in addition to evaluating different reaction times. After optimization, Lepto-LAMP incorporated calcein as an indicator due to its higher analytical sensitivity (10 pg of DNA per reaction, or 0.1; 1 and 10 leptospires/mL in bovine serum, urine, and kidney macerate, respectively). Lepto-LAMP specifically detected DNA from pathogenic and intermediate strains of Leptospira spp.\nLepto-LAMP was compared with the reference technique PCR lipL32 for the detection of leptospiral DNA in animal clinical samples. In a trial using hamsters (Mesocricetus auratus) as a model of animal leptospirosis, Lepto-LAMP allowed for the detection of a greater number of positive samples in infected animals. Both molecular diagnostic techniques showed substantial agreement according to Cohen's Kappa coefficient. Employing clinical samples (serum, urine, and organs) from domestic and wild animals, Lepto-LAMP demonstrated high diagnostic sensitivity (100%, 95% CI: 93.6?100%) and high diagnostic specificity (96.6 %, 95 % CI: 95.2-97.7 %). Lepto-LAMP had a lower implementation cost compared to the endpoint PCR lipL32, making it more accessible for low-complexity laboratories.\nThe use of Lepto-LAMP for the diagnosis of animal leptospirosis has great potential to complement the microscopic agglutination test, the gold standard serological technique for leptospirosis, as it can be implemented in most non-specialized laboratories and provides a short time to obtain results (between 75-90 minutes from DNA extraction with Chelex®100 to final result reading).
Fil: Hamer, Micaela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La leptospirosis es una de las enfermedades zoonóticas más extendidas en el mundo. En Argentina, se considera endémica, con brotes que ocurren principalmente en los períodos de precipitación abundante. Leptospira spp. representa el segundo patógeno abortígeno de mayor importancia en la producción ganadera, responsable de la pérdida de millones de dólares en la industria de carne y de lácteos de la región pampeana. Además del impacto económico de la leptospirosis en la industria animal, esta zoonosis pone en riesgo a los humanos que están en permanente contacto con animales infectados, ya sean domésticos como silvestres. Por estas razones, es importante contar con herramientas de diagnóstico que permitan la detección del agente de manera sencilla y eficaz, para así poder aplicar medidas necesarias para prevenir el contagio y mitigar las consecuencias económicas y sanitarias.\nEl objetivo de este trabajo de tesis fue desarrollar un método de detección de ADN leptospiral basado en la técnica de amplificación isotérmica mediada por loops (LAMP) ideado para su aplicación en laboratorios de baja complejidad, con insumos nacionales y de fácil manejo: Lepto-LAMP.\nEn primera instancia, se evaluaron dos métodos de extracción de ADN, siendo la resina Chelex®100 elegido para aplicarlo a muestras de suero y orina animal, ya que presentó el mayor rendimiento, a pesar de no contar con un paso posterior de purificación. Por otro lado, el kit PURO Genomic DNA® fue seleccionado como método a emplear en muestras de órganos provenientes de animales, ya que permitió la obtención de ADN más puro que la resina.\nDurante el diseño de la reacción LAMP para la detección de ADN leptospiral, se evaluó el empleo de posibles indicadores para la lectura visual directa de resultados: verde de malaquita, SYBR Safe®, azul de hidroxinaftol y calceína; además de evaluar diferentes tiempos de reacción. Luego de la optimización, Lepto-LAMP incorporó la calceína como indicador ya que permitió obtener la mayor sensibilidad analítica (10 pg ADN/reacción, o 0,1; 1 y 10 leptospiras/mL en suero, orina y macerado de riñón de bovinos, respectivamente). Lepto-LAMP permitió detectar específicamente ADN proveniente de cepas patógenas e intermedias de Leptospira spp.\nSe comparó Lepto-LAMP con la técnica de referencia molecular seleccionada, PCR lipL32, para la detección de ADN leptospiral en muestras clínicas animales. En un ensayo con hámsteres (Mesocricetus auratus) como modelo de leptospirosis animal, Lepto-LAMP permitió la detección de mayor cantidad de muestras positivas en los animales infectados. Ambas técnicas diagnósticas moleculares mostraron una concordancia sustancial según el índice Kappa de Cohen. Empleando muestras clínicas (suero, orina y órganos) de animales domésticos y silvestres, Lepto-LAMP presentó alta sensibilidad diagnóstica (100 %, IC 95 %: 93,6 ? 100 %) y alta especificidad diagnóstica (96,6 %, IC 95 %: 95,2 - 97,7 %). Lepto-LAMP tuvo un menor costo de implementación comparado con la técnica PCR lipL32 de punto final por lo que es más accesible para laboratorios de baja complejidad.\nEl empleo de Lepto-LAMP para el diagnóstico de la leptospirosis animal posee un gran potencial para complementar la prueba de aglutinación microscópica, técnica gold standard serológica para leptospirosis, ya que es factible su implementación en la mayoría de los laboratorios no especializados y cuenta con un corto tiempo de obtención de resultados (entre 75 - 90 minutos desde la extracción de ADN con Chelex®100 hasta la lectura del resultado final).
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias de la Salud