Mecanismo de acción de los productos lipoxigenados sobre la esteroidogénesis

• Autores: Leone, María Eugenia
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Cornejo Maciel, Fabiana; Meroni, Silvina; Fernandez Tomé, María del Carmen; Berg, Gabriela
• Materia: OXER1; Estenoides; MA-10; Ácido araquidónico; Lipoxigenados; Esteroidogénesis; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Hormonal regulation of steroidogenesis involves arachidonic acid, precursor of the lipoxygenated products necessary for activation of steroidogenesis, irrespective of the stimulus that triggers the response. In other systems, it is postulated that lipoxygenated metabolites of arachidonic acid are secreted and they would act in an autocrine fashion stimulating a membrane receptor called OXER1. This protein belongs the G protein-coupled receptors with high affinity for 5-oxo-ETE, 5-HPETE and 5- HETE, products of 5-lipoxygenase. Based on this background, we hypothesized that the metabolites of arachidonic acid via the 5-LOX could signal through their own receptor in the regulation of steroidogenesis. In order to identify OXER1 as mediator of the activation of steroidogenesis, initially, we demonstrated the presence of OXER1 receptor in H295R human steroidogenic cells. Then, we modified the activity and the expression of OXER1 in steroidogenic cells. The activity was pharmacologically modified, using an agonist and an antagonist of the receptor. These compounds were able to modify steroid production by H295R cells. In order to modify the expression levels, first we needed to obtain molecular biology tools. So, a specific RNAi was introduced in a pSUPER.retro.puro plasmid and the human cDNA was cloned in pRc/CMVi and pBABE. MA-10 Leydig mouse testis cells and/or H295R human adrenocortical cells were transfected with these constructions. Only the two recombinant plasmids obtained for overexpression were functional as only in these cases the expected change in OXER1 expression (mRNA and/or protein) was achieved. To verify the performance of overexpressed OXER1, we determined the effect of transfection of both plasmids on steroid production in both MA-10 and H295R cells. The stimulation of these cells by agonists that activate signaling pathways that involve both cAMP/PKA and PLC/PKC resulted in an increase in steroidogenesis when OXER1 was overexpressed. Thus, here we presented evidence for the involvement of the membrane receptor OXER1 in the activation of steroid production. Another important contribution of this work is that transfection of cells H295R human adrenocortical cells generated cells that stably express the OXER1. This new cell line, H295R-OXER1, will be a useful tool in future analysis of the signal transduction pathways involved in the activation of the receptor.
Fil: Leone, María Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La regulación hormonal de la esteroidogénesis involucra al ácido araquidónico, precursor de\nlos productos lipoxigenados necesarios para la activación de la esteroidogénesis,\nindependientemente del estímulo que desencadene la respuesta. En otros sistemas, está\npostulado que los productos lipoxigenados son secretados y que funcionarían en forma\nautócrina estimulando un receptor de membrana denominado OXER1 perteneciente a los\nreceptores acoplados a proteína G y con alta afinidad por 5-oxo-ETE, 5-HpETE y 5-HETE,\nproductos de la 5-lipoxigenasa. En base a estos antecedentes, hipotetizamos que los\nmetabolitos del ácido araquidónico vía la 5-LOX podrían señalizar a través de su propio\nreceptor en la regulación de la esteroidogénesis. con una aproximación farmacológica,\ndemostramos que el OXER1 estaría involucrado, al menos en parte, en la vía de transducción\nque involucra al AMPc/PKA.\nCon el fin de identificar al OXER1 como mediador de la activación de la esteroidogénesis,\ninicialmente demostramos la presencia del receptor OXER1 en células esteroidogénicas\nhumanas de la línea H295R productoras de esteroides a través de varias vías de señalización.\nLuego, abordamos la modificación de la actividad y de los niveles de expresión del OXER1 en\ncélulas esteroidogénicas. La actividad se modificó con herramientas farmacológicas, usando\nun agonista y un antagonista del receptor. Estos compuestos fueron capaces de modificar la\nproducción de esteroides por células H295R. Para los cambios en la expresión, fue necesario\nprimero obtener herramientas de biología molecular para realizar el silenciamiento y la\nsobreexpresión, parte fundamental del trabajo que se presenta. Entonces, se obtuvo un\nplásmido pSUPER.retro.puro-OXER1 para el silenciamiento y se clonó el ADNc humano\ngenerando plásmidos de expresión transitoria y estable: pRc/CMVi-OXER1 y pBABE-OXER1,\nrespectivamente. Con estas construcciones se transfectaron células de las líneas MA-10 de\nLeydig de testículo de ratón y/o células H295R adrenocorticales humanas. Solo los dos\nplásmidos recombinantes obtenidos para la sobreexpresión fueron aptos para el uso ya que\núnicamente con ellos se logró el cambio esperado de la expresión del OXER1 (ARNm y/o\nproteína). Para analizar la funcionalidad del OXER1 sobreexpresado, determinamos el efecto\nde la transfección de ambos plásmidos sobre la producción de esteroides tanto en células MA-\n10 como H295R. La estimulación de estas células por agonistas que activan vías de\nseñalización que involucran tanto AMPc/PKA como PLC/PKC resultó en un aumento en la esteroidogénesis cuando se sobreexpresa el OXER1. Este trabajo entonces aporta evidencia de la participación del receptor de membrana OXER1 en la activación de la producción de esteroides. Otro aporte relevante de este trabajo es que la transfección de células H295R adrenocorticales humanas generó células que expresan en forma estable al OXER1. Esta nueva línea celular, H295R-OXER1, es un sistema de estudio de gran utilidad en el futuro análisis de la transducción de señales iniciada por la activación del receptor.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica