Efecto de ?-hemolisina de Escherichia coli sobre eritrocitos humanos

• Autores: Lauri, Natalia
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Herlax, Vanesa Silvana; Schwarzbaum, Pablo Julio; Álvarez, Silvia; Ozu, Marcelo; Larocca, Cecilia
• Materia: ATP extracelular; Eritrocitos humanos; Alfa-hemollisina; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Lauri, Natalia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Escherichia coli es un componente habitual de la microbiota intestinal humana, que en ciertos casos puede colonizar e infectar otros órganos. Las cepas uropatogénicas de E. coli son responsables de la mayoría de las infecciones del tracto urinario. Durante la infección, estas bacterias pueden llegar al tejido renal y, en casos graves, alcanzar la circulación sanguínea y causar sepsis. Uno de los factores de virulencia producidos por las cepas uropatogénicas de E. coli es la toxina ?-hemolisina (HlyA), una proteína de 110 kDa perteneciente a la familia de las exotoxinas RTX (Repeat in toxin).\nCuando las E. coli uropatogénicas liberan HlyA en el torrente sanguíneo, la toxina puede atacar a células sanguíneas como eritrocitos y leucocitos, así como a células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos. La exposición de eritrocitos humanos a HlyA provoca cambios morfológicos, liberación de ATP y aumento del volumen celular que culmina en la hemólisis.\nEl ATP liberado por los eritrocitos humanos y otras células desempeñan un papel importante de señalización al interactuar con receptores purinérgicos de manera autocrina o paracrina, modulando la respuesta inmunitaria, la inflamación, la agregación plaquetaria y otras funciones celulares. En ausencia de hemólisis, la regulación de ATP extracelular depende del balance entre la liberación del nucleótido desde el interior de células viables a través de mecanismos regulados no líticos, y el consumo del ATP extracelular acumulado, facilitado por la actividad de ectonucleotidasas. Adicionalmente, la hemólisis puede liberar al medio tanto ATP como ATPasas intracelulares, pudiendo éstas hidrolizar ATP extracelular.\nEn esta tesis se evaluaron los efectos de HlyA de E. coli sobre los eritrocitos humanos, y su impacto en la regulación del ATP extracelular, la señalización purinérgica asociada, cambios morfológicos y de volumen celular, y hemólisis.\nLa exposición de eritrocitos a bajas concentraciones de HlyA provocó un aumento agudo tanto en la liberación de ATP como en la hemólisis, y estos cambios dependieron del tiempo de exposición a la toxina. La hemólisis contribuyó significativamente a la liberación de ATP, y el ATP extracelular acumulado fue hidrolizado tanto por ectonucleotidasas como por ATPasas intracelulares liberadas por la hemólisis. Estos procesos fueron cuantificados y modelados matemáticamente, permitiendo conocer la contribución relativa de cada proceso en la regulación de ATP extracelular. De esta manera, se pudo determinar que existen flujos líticos y no líticos de salida de ATP que controlan la cinética de ATP extracelular; y que la hidrólisis de ATP extracelular fue relativamente baja a corto plazo pero se incrementa con el tiempo de incubación, en consonancia con el aumento de la hemólisis y la concentración de ATP extracelular.\nEn células viables, la liberación regulada de ATP no comprometió el estado energético de los eritrocitos a corto plazo, pero puede afectarlo con tiempos de incubación más prolongados.\nPor otro lado, se determinó que la interacción de HlyA con los lípidos de membrana no es suficiente para activar la liberación de ATP y la hemólisis, sugiriendo la necesidad de proteínas integrales de membrana del eritrocito que medien la salida de ATP. En este sentido, se comprobó que una de estas proteínas es panexina 1.\nAdemás, el tratamiento de eritrocitos con HlyA indujo cambios morfológicos y del volumen celular, conduciendo a una transición a través de los estados de discos bicóncavos, equinocitos y esferocitos, a medida que experimentaban procesos de shrinking (disminución de volumen celular) seguido de swelling (aumento de volumen celular). Al evaluar la relación entre la concentración de ATP extracelular y el volumen celular, se estableció una regulación recíproca entre ambos procesos, cuyo nexo fue la señalización purinérgica. Es decir, la exposición a la toxina indujo liberación de ATP citosólico y la acumulación resultante de ATP extracelular generó la activación de receptores purinérgicos P2X, induciendo el swelling, una mayor salida de ATP y hemólisis. De esta manera, se generó un bucle de retroalimentación positivo que aceleró el aumento de ATP extracelular, volumen celular y hemólisis, siendo los receptores P2X el nexo clave entre estas variables.\nEl efecto de HlyA sobre el volumen celular y el movimiento de agua a través de la membrana plasmática se debió a la alteración de los niveles de iones intracelulares, lo que condujo a cambios en la polaridad de la membrana plasmática. En cuanto al potencial eléctrico de membrana de los eritrocitos, durante el tratamiento con HlyA aumentaron las concentraciones intracelulares de Ca2+ y Na+ y disminuyó la de K+, correlacionando estos cambios con hiperpolarización y posterior despolarización de la membrana plasmática.\nPor último, la toxina también indujo reducción de la deformabilidad, mayor fragilidad osmótica en condiciones hipotónicas y aumento de la adhesividad de los eritrocitos al endotelio vascular activado, provocada por la externalización de fosfatidilserina.\nEn resumen, la exposición a la toxina HlyA de E. coli desencadena una serie de eventos en los eritrocitos humanos, incluida la liberación de ATP, cambios morfológicos y alteraciones del volumen celular. Estos efectos están regulados por múltiples mecanismos, incluida la acción coordinada de los flujos líticos y no líticos de salida de ATP, así como la señalización purinérgica a través de los receptores P2X. Además, la alteración del volumen celular está relacionada con cambios en los niveles de iones intracelulares, lo que afecta el potencial eléctrico de la membrana plasmática. La comprensión de cómo HlyA afecta el volumen celular y la homeostasis de ATP extracelular en los eritrocitos proporciona una visión más completa de las infecciones por cepas uropatogénicas de E. coli y sus consecuencias en la regulación celular.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas