Estudio de la dinámica del tejido linfoide en mucosas de pequeños rumiantes para su aplicación en el diagnóstico de scrapie

• Autores: Gallardo, Mauro Julián
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Chacana, Pablo; Delgado, Fernando
• Materia: Scrapie; Inmunohistoquímica; Tejido linfoide; Priones; Encefalopatías espongiformes transmisibles; Pequeños rumiantes; Ciencias Veterinarias
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) are a group of neurodegenerative diseases\nproduced by prions that affect humans and different animal species. They have a chronic course, neurological manifestations and invariably end with the death of the affected\nindividuals, lacking treatment to date. Of all the animal TSEs, scrapie affects sheep and goats is\nthe most widespread animal TSE, reporting the highest number of new cases per year, and creates trade barriers for small ruminants. In Argentina, no cases of scrapie or other animal\nTSEs have been identified.\nThe diagnosis of TSEs is based on postmortem detection of abnormal prion protein (PrPSc) by\nimmunohistochemistry, Western blotting, or ELISA. In the case of scrapie, antemortem diagnosis of the disease is possible given the particular early accumulation of PrPSc in lymphoid\ntissue (LT). PrPSc accumulates in lymphoid follicles of tonsils, lymph nodes, and mucosal\nlymphatic organizations. Due to its easy access, the detection of PrPSc in the LT of the third eyelid has been proposed, also evaluating the detection in rectal mucosa biopsies.\nThe objective of this thesis was to determine if there are variations in the lymphoid tissue associated with easily accessible mucosa of sheep and goats in relation to their age, to evaluate\ntheir composition, and to obtain diagnostic tools for scrapie. For this, the diagnostic aptitude of\nbiopsy samples from the third eyelid and rectum of sheep and goats from the provinces of Buenos Aires and Salta, respectively, was evaluated and their cellular components were\ncharacterized. In turn, an anti-PrPC antibody was developed and an immunohistochemistry\n(IHC) technique was optimized to recognize this protein and PrPSc in samples from infected\nsheep and cattle.\nPostmortem mucosa samples were taken from the third eyelid and rectal mucosa (simulating a\nbiopsy), and the contralateral eyelid of 66 sheep (30 over and 36 under 18 months) and 54\ngoats. The terminal portion of the rectum and anus of 35 sheep were also collected. They were\nfixed in 10% formalin and subsequently processed for histological analysis. The bibliography considers samples suitable for diagnosis to be those that present a minimum of 6 lymphoid follicles. According to it, only 1.8% of the conjunctival samples and 39.4% of the rectal samples\nof sheep were suitable. Regarding goats, 5.4 and 61.1% of the third eyelid and rectal mucosa\nsamples respectively met the aptitude criteria for diagnosis of scrapie. In the histological evaluation of the contralateral eyelid, lymphoid tissue was found only in 16.7% of the sheep\nand 50% of the goats. On the other hand, in the study of the rectum and anus, lymphoid tissue\nwas observed immediately after the mucocutaneous junction (23 samples suitable for diagnosis/35 total), which would decrease its presence towards the cranium (6/35 of the\nsamples taken at 2 cm of the union were suitable). These results suggest that biopsy of the third eyelid would not be useful for the diagnosis of scrapie due to the scarce development of LT. On the other hand, a biopsy of the rectal mucosa would be useful, considering the presence of lymphoid tissue in sufficient quantity. No statistically significant differences were found\nbetween the two age groups evaluated (over and under 18 months), so age would not influence the aptitude of these samples. The IHC technique was useful for the characterization of cell populations of the immune\nsystem. CD21+, CD3+ and L1+ cells were detected in both species, with no differences in\nimmunolabeling patterns with respect to species or age. CD21+ cells were observed inside the\nlymphoid follicles mainly in the germinal centers. This was to be expected since it is a marker of dendritic cells and mature B lymphocytes, which have this location. There were significant\ndifferences in CD21 labeling between rectal and third eyelid samples from sheep, finding a proportion of densely packed lymphoid follicles with scarce or no presence of CD21+ cells in\nthird eyelid samples. Due to the differences found and the importance of the presence of CDF\n(CD21+) for the accumulation of PrPSc in the LT of infected animals, the presence of germinal\ncenters should be considered in determining the diagnostic aptitude of the samples for the\ndiagnosis of scrapie.\nCD3+ cells were observed with a mainly perifollicular distribution, consistent with the distribution of T lymphocytes. However, labeling was also demonstrated in cells from the follicles. L1+ cells were found in low numbers in interfollicular regions consistent with the\ndistribution of macrophages. This coincides with what has been described by other authors. From a recombinant PrPC\n, it was possible to produce an IgY antibody capable of detecting ovine\nPrPC and PrPSc by IHC in ovine and bovine tissues with scrapie and BSE. The immunostaining pattern observed in the tissues was similar to that obtained using commercial antibodies.\nIt was not possible to detect PrPC in lymphoid tissue fixed in 10% formalin with the antibody developed or with the commercial antibodies used, contrary to what was reported by other\nauthors. This would be related to the fixative and/or procedures performed, as well as the lower detection capacity of the antibodies used in this work.\nThe results of this work indicate that the presence of lymphoid tissue in the evaluated mucosa\nwould not be associated with the age of the sheep. In the palpebral mucosa it would have less development, being easily detectable in the rectum, immediately before the mucocutaneous\njunction. This would be the sample of choice in the event of implementing a scrapie preclinical\ndiagnosis strategy. The antibody developed could be useful in the future in assays for the diagnosis of animal TSEs. For this, future studies will be necessary in order to characterize\nconcentrations of work and inputs for developing.
Fil: Gallardo, Mauro Julián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades\nneurodegenerativas producidas por priones que afectan al ser humano y a diferentes especies\nanimales. Son de curso crónico, tienen manifestaciones neurológicas y terminan\ninvariablemente con la muerte de los individuos afectados, careciéndose a la fecha de un tratamiento. De todas las EET animales, scrapie o prurigo lumbar que afecta a ovinos y caprinos, es la de mayor difusión, reportándose el mayor número de casos nuevos por año, y genera barreras comerciales para pequeños rumiantes. En la Argentina no se han identificado\ncasos de scrapie ni de otras EET animales. El diagnóstico de las EET se basa en la detección postmortem de la proteína priónica anómala\n(PrPSc) mediante inmunohistoquímica, Western blot o ELISA. En el caso de Scrapie es posible el diagnóstico antemortem de la enfermedad dada la particular acumulación temprana de PrPSc\nen tejido linfoide (TL). La PrPSc se acumula en los folículos linfoides de tonsilas, ganglios\nlinfáticos y organizaciones linfáticas presentes en mucosas. Por su fácil acceso, se ha propuesto\nla detección de PrPSc en el TL del tercer párpado, evaluándose también la detección en biopsias\nde mucosa rectal.\nEl objetivo de esta tesis fue determinar si existen variaciones en el tejido linfoide asociado a\nmucosas de fácil acceso de ovinos y caprinos en relación a su edad, evaluar su composición, y\nobtener herramientas diagnósticas para scrapie. Para eso se evaluó la aptitud diagnóstica de\nmuestras de biopsia del tercer parpado y recto de ovinos y caprinos de las provincias de Buenos\nAires y Salta respectivamente y se caracterizaron sus componentes celulares. A su vez, se desarrolló un anticuerpo anti PrPC y se optimizó una técnica de inmunohistoquímica (IHQ) para reconocer esta proteína y PrPSc en muestras de ovinos sanos y con scrapie, y bovinos con EEB. Se tomaron postmortem muestras de mucosa del tercer párpado y mucosa rectal (simulando\nuna biopsia), y el párpado contralateral de 66 ovinos (30 mayores y 36 menores de 18 meses) y\n54 caprinos. También se colectó la porción terminal del recto y el ano de 35 ovinos. Se fijaron\nen formol al 10% y posteriormente se procesaron para su análisis histológico. La bibliografía\nconsidera muestras aptas para diagnostico aquellas que presenten un mínimo 6 folículos linfoides. De acuerdo al mismo fueron aptas solo el 1,8% de las muestras conjuntivales y el\n39,4% de las muestras rectales de los ovinos. En cuanto a los caprinos, el 5,4 y 61,1% de las muestras de mucosas de tercer parpado y rectal respectivamente cumplieron el criterio de\naptitud para diagnóstico de scrapie. En la evaluación histológica del párpado contralateral se\nencontró tejido linfoide solo en el 16,7% de los ovinos y el 50% de los en caprinos. Por otro lado, en el estudio de recto y ano se observó tejido linfoide inmediatamente posterior a la unión mucocutánea (23 muestras aptas para el diagnóstico/35 total), el cual disminuiría su\npresencia hacia craneal (6/35 de las muestras tomadas a 2 cm de la unión fueron aptas). Estos\nresultados sugieren que la biopsia de tercer párpado no sería de utilidad para el diagnóstico de\nscrapie debido al escaso desarrollo del TL. Por otro lado, la biopsia de mucosa rectal sería de utilidad, debiendo considerarse la presencia de tejido linfoide en cantidad suficiente al\nmomento del diagnóstico. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre\nlos dos grupos etarios evaluados (mayores y menores a 18 meses), por lo cual la edad no tendría influencia en la aptitud de estas muestras. La técnica de IHQ fue de utilidad para la caracterización de poblaciones de células del sistema inmune. Se detectaron células CD21+, CD3+ y L1+ en ambas especies, sin diferencias en los patrones de inmunomarcación respecto de la especie o edad. Se observaron células CD21+ en el interior de los folículos linfoides principalmente en los centros germinativos. Esto era de\nesperarse ya que es un marcador de células dendríticas foliculares (CDF) y linfocitos B maduros,\nlos cuales tienen esa localización. Existieron diferencias significativas en la marcación de CD21\nentre las muestras rectales y de tercer párpado de ovinos, encontrando una proporción de folículos linfoides densamente empaquetados con escasa o nula presencia de células CD21+ en\nlas muestras de tercer párpado. Debido a las diferencias encontradas y la importancia de la\npresencia de CDF (CD21+) para la acumulación de PrPSc en el TL de los animales infectados,\ndebería considerarse la presencia de centros germinativos en la determinación de la aptitud\ndiagnóstica de las muestras para el diagnóstico de scrapie. Las células CD3+ se observaron con una distribución perifolicular principalmente, coincidente\ncon la distribución de linfocitos T. Sin embargo, también se observó marcación en células de los\nfolículos. Las células L1+ se encontraron en baja cantidad en regiones interfoliculares\ncoincidente con la distribución de macrófagos. Esto concuerda con lo descripto por otros\nautores. A partir de obtener una PrPC recombinante, se logró producir un anticuerpo IgY capaz de detectar por IHQ PrPC ovina y PrPSc en tejidos de ovinos y bovinos con scrapie y EEB. El patrón\nde inmunomarcación observado en los tejidos fue similar al obtenido mediante el uso de anticuerpos comerciales. No se logró detectar PrPC en tejido linfoide fijado en formol 10% con el anticuerpo desarrollado ni con los anticuerpos comerciales utilizados, en contrario a lo reportado por otros autores.\nEsto tendría relación con el fijador y/o procedimientos realizados, como con la menor capacidad de detección de los anticuerpos utilizados en este trabajo.\nLos resultados del presente trabajo indican que la presencia de tejido linfoide en las mucosas\nevaluadas no estaría asociado a la edad de los ovinos. En la mucosa palpebral tendría un menor\ndesarrollo, siendo fácilmente detectable en el recto, inmediatamente anterior a la unión mucocutánea. Esta sería la muestra de elección en caso de implementarse una estrategia de\ndiagnóstico preclínico de scrapie. El anticuerpo desarrollado podría ser de utilidad en el futuro\nen ensayos para diagnóstico de EET animales. Para ello serán necesarios futuros estudios a fin de caracterizar concentraciones de trabajo e insumos para revelado.
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias