Caracterización del epítope sulfatado presente en el dominio C-Terminal de la cruzipaína, cisteína proteasa mayoritaria de trypanosoma cruzi y su participación en la infección y en...

• Autores: Soprano, Luciana Lía
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Venturiello, Stella Maris; Duschak, Vilma G.; Nowicki, Cristina; González Cappa, Stella; Corral, Ricardo
• Materia: Etíope sulfatado; Cruzipaína; Trypanosoma cruzi; Enfermedad de Chagas; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Soprano, Luciana Lía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Para llevar a cabo este estudio, se purificaron los antígenos a homogeneidad, se sometieron a\ntratamientos de desulfatación y se inmunizaron conejos y ratones con las moléculas tal cual y desulfatadas. La cruzipaína, cisteína proteinasa principal de Trypanosoma cruzi, contiene oligosacáridos sulfatados de alta manosa como componentes de esta glicoproteína. Hemos\ndeterminado previamente que estos grupos sulfato son blancos de respuestas inmunes específicas.\nCon el fin de evaluar los requerimientos estructurales para el reconocimiento inmune y teniendo en cuenta que el epitope de Cz sulfatado aislado no esta disponible en cantidades suficientes para desarrollar estudios sistemáticos de estructura-actividad, llevamos a cabo un análisis indirecto de las\ncaracterísticas químicas necesarias para la unión de los anticuerpos al epítope sulfatado de la Cz\nmediante inmunoensayos. Con este objetivo, diferentes moléculas sintéticas fueron acopladas a la/las proteínas BSA y aprotinina y confrontadas con: i) sueros de ratones específicos para Cz y C-T, ii) anticuerpos producidos en conejos inmunizados con Cz y C-T , y iii) IgGs purificadas a partir de\nsueros de pacientes con Enfermedad de Chagas crónica. Nuestros resultados indicaron que una glucosamina conteniendo un grupo sulfato esterificado en posición O-6 y un grupo N-acetilo fue el epítope preferido para el reconocimiento inmune del suero específico para Cz y su dominio Cterminal.\nSi bien en menor grado, otros compuestos que contienen diferentes grupos aniónicos cargados fueron también reconocidos. Finalmente, nuestros hallazgos mostraron que la afinidad del C-T por los anticuerpos IgGs purificados de suero de ratón específico para este dominio, así como\ntambién de sueros de pacientes con Enfermedad de Chagas es inhibida por el azúcar sintético aniónico\nNAcGlc6SO3, evidenciando que estos motivos carbohidrato sulfatados juegan un rol central en la\nunión de este antígeno mayoritario a sus anticuerpos específicos, imitando al epitope sulfatado de la Cz ubicado en los N-glicanos de la extensión C-terminal de la molécula de Cz. La caracterización del\nepítope sulfatado de la cruzipaína hizo posible el estudio de una serie de inmunizaciones con el\ndominio C-T, el epítope sulfatado y con IgGs sulfato-específicos. Se inmunizaron ratones BALB/c con C-T y C-Td. Los inmunizados con C-T mostraron relación IgG2a/IgG1<1, bajos niveles de IL-4 y elevada concentración de IFN-?.por ELISA de captura usando C-T como estímulo y un perfil de citoquinas compatible con una respuesta mixta con tendencia Th2 con niveles excesivamente\nelevados de IFN? e IL-17. Los inmunizados con C-Td presentaron una IgG2a/IgG1<1; IL-4\nindetectable, bajo nivel de IFN-? y un perfil de citoquinas similar al control con IL-10\nsignificativamente elevado. Se observaron alteraciones ultraestrucurales cardíacas y mayor inmunoreconocimiento\nde fibrillas y mitocondrias en inmunizados con C-T con suero policonal anti-Cz y anti-Cz/d ads con miosina. Luego del desafío subletal se observaron parasitemias elevadas. La\nmortalidad fue del 20% en inmunizados con C-T y 80% en inmunizados con C-Td, observando\nseveras alteraciones musculares en los sobrevivientes del grupo C-Td. Se acopló a BSA NAcGlc6SO3\ny NAcGlc. Los inmunizados con BSA-NAcGlc6SO3 montaron una respuesta inmune con predominio de IgG1 e IgG2b seguido de IgG2a, y respuesta celular T de memoria, mientras en el grupo BSANAcGlc\npredominó IgG2a. Luego de la infección subletal, los inmunizados con el epítope sulfatado desarrollaron parasitemias excesivamente elevadas y niveles similares de IFN-? que el grupo BSANAcGlc\nque presentó ~70 % de mortalidad. Se purificaron IgGs a partir del suero de los inmunizados\ncon BSA-NAcGlc6SO3 y de ratón pre-inmune y se hizo tratamiento por tranferencia pasiva de\nanticuerpos. Los ratones que recibieron IgGs sulfato-específicos presentaron alteraciones\nultraestructurales en tejido cardíaco. Luego del desafío, los que recibieron IgGs sulfato-específicos\npresentaron mayores parasitemias que los controles. Se determinó la variación de los nivesles de IgG2 sulfato específicos en pacientes con enfermedad de Chagas crónica durante la progresíon de la\nenfermedad cardíaca. Los ensayos realizados permitieron evaluar el rol de los epítopes sulfatados\npresentes en glicoconjugados de T. cruzi en la infección y patogenia de la enfermedad de Chagas.
Parasitología
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica