Protozoarios entéricos con potencial zoonótico : desarrollo de metodologías de diagnóstico molecular y estudio de mecanismos de virulencia en Entamoeba histolytica

• Autores: Lopez Arias, Ludmila Sol
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Garbossa, Graciela (directora); Farber, Marisa Diana (directora)
• Materia: Parasitology; Zoonoses; Swine; Transfer RNA; Entamoeba; Diagnosis; Virulence; Parasitología; Zoonosis; Cerdo; Balantidium; ARN de Transferencia; Diagnóstico; Virulencia; Entamoeba histolytica; Enteroparasitosis
• Institución: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria

Tesis presentada para optar por el título de Doctora en el área Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en marzo de 2016
Las infecciones parasitarias entéricas constituyen un problema sanitario muy común entre los animales de granja y, debido al potencial zoonótico de algunos parásitos, el contacto con los especímenes infectados puede causar enfermedades en los seres humanos. En Misión Nueva Pompeya (MNP) Chaco, existen condiciones de saneamiento ambiental de riesgo para las comunidades Wichí que allí habitan. Las lagunas constituyen la principal fuente de abastecimiento de agua y, dado que son además, abrevaderos para los animales silvestres, domésticos y ganado, soportan el aflujo de excretas las cuales son arrastradas por acción eólica y pluvial. Un relevamiento epidemiológico en la región indicó que el 92% de los niños Wichís padece enteroparasitosis transmitidas por el agua. Para determinar si existe riesgo de transmisión zoonótica de protozoosis en MNP, se desarrollaron PCRs diagnósticas y una membrana de hibridización reversa en línea para la identificación de los protozoarios. Se identificaron en heces animales Entamoeba bovis, Entamoeba polecki y Balantidium coli. Estas últimas fueron también halladas en heces de niños residentes de MNP. Los cerdos presentaron mayor diversidad de parásitos. Por otra parte, Entamoeba histolytica es el agente causal de amebiasis intestinal. Estudios han demostrado que contiene elementos repetitivos en su genoma: LINEs y SINEs y los Elementos Repetitivos Específicos de Entamoeba: ERE2. Este trabajo mostró que los elementos LINE son más abundantes que ERE2 y SINE (1879, 1268 y 867, respectivamente). El 25,9% de los genes de E. histolytica están próximos a estos elementos. Las funciones moleculares de estos genes fueron establecidas por medio de la Ontología Génica. Se determinaron 7 funciones moleculares, todas con posibles contribuciones a mecanismos de patogenicidad: Unión a GTP, Actividad tipo cisteína peptidasa, Actividad oxidoreductasa, Actividad Nucleosido-trifosfatasa, Actividad ATPasa y Actividad 2-alkenal reductasa. 6 se encontraban asociadas a los elementos repetitivos específicos de Entamoeba (ERE2), 3 a LINE y 3 a SINE. El algoritmo de análisis in sillico desarrollado permitió obtener genes candidatos para validarse como genes implicados en mecanismos de patogenicidad. Mediante ensayos de silenciamiento por ARN interferente se obtuvieron trofozoítos silenciados transitorios para el gen Cisteína proteinasa. Ensayos funcionales indicaron una disminución en la eritrofagocitosis y en el daño celular. Esto demuestra que existiría una relación entre ERE2, y los diferentes estados de virulencia del parásito ya que los genes aledaños (potencialmente susceptibles a la modulación por estos ETs) codifican para proteínas con posibles contribuciones a mecanismos de patogenicidad.
Enteric parasitic infections are a very common health problem among farm and domestic animals because many of them can cause several diseases in humans. The infection can be acquired through the ingestion of parasite infective stages contained in feces, thus, the contact with animals, soil or consumption of vegetables and water contaminated with infected feces present health hazards. Misión Nueva Pompeya is located in the northwest of the Province of Chaco. In this place, the environmental sanitary conditions are a risk factor to rural Wichí communities that live there. The lagoons are the main source of water supply of lakeshore communities and also they are troughs for wildlife, pets and livestock. Moreover, they support the flow of excreta carried by wind and rain action. In such a scenario, the direct consequence is the serious water contamination with bacteria, protozoa and helminths. In order to establish if there is a risk of zoonotic transmission of protozoosis, it was necessary to develop molecular diagnostic tools: PCRs and RLBH (Reverse Line Blot Hybridization). These tools allowed to identify unequivocally the presence of Entamoeba bovis, Entamoeba polecki and Balantidium coli. The highest diversity of protozoan parasites was found in pigs. Moreover, Entamoeba histolytica is the causative agent of intestinal amebiasis. This parasite mainly affects humans. The infection is acquired by the ingestion of cysts; once these cysts are ingested, they excyst in the gut releasing the trophozoites. There are mechanisms that allow trophozoites to invade and survive in the host: the ability to adhere to the intestinal epithelium, the cytotoxic capacity and the ability to engulf host cells. At present, studies have shown that E. histolytica contain a large repertoire of repetitive elements (transposable elements, TEs) that consist in non-Long Terminal Repeats retrotransposons: Long and Short Interspersed Elements (LINEs and SINEs) and Entamoeba Repetitive Element (ERE2). These transposable elements (TE) can give rise to the appearance of different virulent phenotypes by changing the expression of adjacent genes. In this context, our goal was to analyze the distribution of TE in the genome of E. histolytica HM-1: IMSS and to assess their impact on the expression of near genes involved in pathogenicity mechanisms. To analyze the distribution of TEs, we run the Repeat Masker software using the E. histolytica genome and a database containing all its reported TEs (SINE, LINE1 and ERE2). Subsequently, to display the annotation and the TEs we used the free software ARTEMIS. To estimate the potential impact of TEs on gene expression we performed a functional categorization of associated genes based on GO (Gene Ontology) terms, in order to reveal the relation of the TE insertions with functional categories. The mapping of TEs showed that the abundance of LINEs was greater than that of SINEs and ERE2 (1879, 1268 y 867 copies, respectively). GTP binding, Rab GTPase activator activity, Cysteine-type peptidase activity, Oxidoreductase activity, ATPase activity, Nucleosidetriphosphatase activity and 2-alkenal reductase [NAD(P)] activity were the molecular functions found to be statistically significant. This analysis revealed that ERE2 is the TE with more categories of molecular functions associated (6 out of 7), while LINE and SINE are in association with 3 categories only. In order to validate that certain genes found near of TEs, are involved in the virulence of the parasite, candidate genes were selected and silencing assays were performed using the technique of RNA interference. In order to evaluate its effect on the phenotype of E. histolytica HM1:IMMS, in vitro virulence assays were performed.
Instituto de Biotecnología
Fil: Lopez Arias, Ludmila Sol. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Ecología, Genética y Evolución; Argentina
Fil: Lopez Arias, Ludmila Sol. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina