A practical approach of gene silencing in the haloarchaeon Haloferax volcanii using CRSPRi technology
- Autores
- Cerletti, Micaela; Gimenez, Maria Ines; Costa, Mariana Inés; Bauer, Julius; De Luca, Iara; Fernandez, Gonzalo; Frecha, Sofía Denise; González Blotta, Lucía; Landaburu, Marina; Lorenzani, Salvador Colombo; Prado, Maira; Schiel, Paula; Ferrari, María Celeste; de Castro, Rosana Esther; Paggi, Roberto Alejandro
- Año de publicación
- 2023
- Idioma
- inglés
- Tipo de recurso
- documento de conferencia
- Estado
- versión publicada
- Descripción
- Laboratory practices (LP) as a didactic strategy involve a dynamic teaching-learningprocess. This allows students to perform psychomotor and social actions throughcollaborative work (experimental work), associate various sources of information togenerate new conceptions, and reinforce theoretical concepts (elaboration of a report).Based on this, in the Biology and Biochemistry of Microorganisms course, we developedthis LP to conceptualize gene silencing through the inactivation of a gene using interferenceRNA (RNAi). In recent years, the CRISPR-Cas system, which represents the adaptiveimmune system of bacteria and archaea, has been adapted to specifically silence genes(interference CRISPR, CRISPRi). The CRISPR-Cas system in Haloferax volcanii wasmodified for gene repression in plasmids or chromosomes. Studies conducted by ourresearch group have shown that the biosynthesis of carotenoid pigments in H. volcanii,among other processes, is regulated by the membrane protease LonB. The followingobjectives were proposed for the LP: a) generate a mutant strain with reduced expressionof the lonB gene in H. volcanii using CRISPRi; b) verify the silencing of the lonB usingWestern blot (WB); c) determine the effect of silencing on pigment synthesis and growthrate. The students were divided into groups and carried out protocols that allowed them totransform H. volcanii with three RNAi constructs, analyze the phenotype of the transformedcells, perform a WB with anti-Lon antibodies, monitor growth, and extract pigments andestimate their concentration in control and silenced strains as methods to determine thesilencing of lonB and its effect on physiology. Strains with reduced expression of the LonBprotease gene were obtained in H. volcanii with two of the constructs, confirming silencingthrough WB. On the other hand, it was determined that silencing led to an increase in pigment concentration and a decrease in growth rate. The obtained results were elaboratedand presented in a final report with a scientific paper format.
Fil: Cerletti, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Costa, Mariana Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Bauer, Julius. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fil: De Luca, Iara. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fil: Fernandez, Gonzalo. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fil: Frecha, Sofía Denise. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: González Blotta, Lucía. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fil: Landaburu, Marina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fil: Lorenzani, Salvador Colombo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Prado, Maira. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina
Fil: Schiel, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Ferrari, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Paggi, Roberto Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
XVIII congreso de la Sociedad Argentina de Microbiologia General
Chapadmalal
Argentina
Sociedad Argentina de Microbiología General - Materia
-
Teaching Lab
Microbiology
CRISPRi - Nivel de accesibilidad
- acceso abierto
- Condiciones de uso
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A practical approach of gene silencing in the haloarchaeon Haloferax volcanii using CRSPRi technologyCerletti, MicaelaGimenez, Maria InesCosta, Mariana InésBauer, JuliusDe Luca, IaraFernandez, GonzaloFrecha, Sofía DeniseGonzález Blotta, LucíaLandaburu, MarinaLorenzani, Salvador ColomboPrado, MairaSchiel, PaulaFerrari, María Celestede Castro, Rosana EstherPaggi, Roberto AlejandroTeaching LabMicrobiologyCRISPRihttps://purl.org/becyt/ford/1.6https://purl.org/becyt/ford/1Laboratory practices (LP) as a didactic strategy involve a dynamic teaching-learningprocess. This allows students to perform psychomotor and social actions throughcollaborative work (experimental work), associate various sources of information togenerate new conceptions, and reinforce theoretical concepts (elaboration of a report).Based on this, in the Biology and Biochemistry of Microorganisms course, we developedthis LP to conceptualize gene silencing through the inactivation of a gene using interferenceRNA (RNAi). In recent years, the CRISPR-Cas system, which represents the adaptiveimmune system of bacteria and archaea, has been adapted to specifically silence genes(interference CRISPR, CRISPRi). The CRISPR-Cas system in Haloferax volcanii wasmodified for gene repression in plasmids or chromosomes. Studies conducted by ourresearch group have shown that the biosynthesis of carotenoid pigments in H. volcanii,among other processes, is regulated by the membrane protease LonB. The followingobjectives were proposed for the LP: a) generate a mutant strain with reduced expressionof the lonB gene in H. volcanii using CRISPRi; b) verify the silencing of the lonB usingWestern blot (WB); c) determine the effect of silencing on pigment synthesis and growthrate. The students were divided into groups and carried out protocols that allowed them totransform H. volcanii with three RNAi constructs, analyze the phenotype of the transformedcells, perform a WB with anti-Lon antibodies, monitor growth, and extract pigments andestimate their concentration in control and silenced strains as methods to determine thesilencing of lonB and its effect on physiology. Strains with reduced expression of the LonBprotease gene were obtained in H. volcanii with two of the constructs, confirming silencingthrough WB. On the other hand, it was determined that silencing led to an increase in pigment concentration and a decrease in growth rate. The obtained results were elaboratedand presented in a final report with a scientific paper format.Fil: Cerletti, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Costa, Mariana Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Bauer, Julius. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: De Luca, Iara. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Fernandez, Gonzalo. 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The obtained results were elaboratedand presented in a final report with a scientific paper format. Fil: Cerletti, Micaela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina Fil: Gimenez, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina Fil: Costa, Mariana Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. 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