Aplicación de la tecnología CRISPRi para silenciar genes en las arqueas

Autores
de Castro, Rosana Esther; Ferrari, María Celeste; Schwarz, T. S.; Marchfelder, A.
Año de publicación
2021
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
documento de conferencia
Estado
versión publicada
Descripción
CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated) es un mecanismo que han desarrollado los procariotas (bacterias y arqueas) para defenderse de elementos genéticos invasores. Si bien existen diferentes versiones, todas tienen en común dos componentes esenciales para su funcionamiento: las proteínas Cas y ARNs reguladores (crRNAs). Las proteínas Cas son guiadas por el crRNA hacia una secuencia diana específica que es luego degradada por las proteínas Cas. El sistema CRISPR-Cas (tipo II CRISPR-Cas-9) ha sido adaptado y se aplica como herramienta para la edición de genomas y regulación de la expresión génica en bacterias y eucariontes. En las arqueas el sistema CRISPR-Cas se encuentra ampliamente distribuido (90 %) y uno de los más caracterizados es el de Haloferax volcanii, organismo que se desarrolla en ambienteshipesalinos (>1,5 M NaCl) y es considerado un modelo para estudios fundamentales de la biología arqueana. H. volcanii contiene un sistema CRISPR-Cas tipo I-B compuesto por tres loci CRISPR yocho proteínas Cas, entre las cuales Cas3 es la endonucleasa que degrada al ADN diana. Elsistema endógeno de H. volcanii ha sido modificado para silenciar genes, ampliando de este modo la disponibilidad de estrategias moleculares para manipular la genética y fisiología en estos organismos. La tecnología CRISPR de interferencia (CRISPRi) en H. volcanii permite reprimir la expresión de genes esenciales para explorar su función, es aplicable a genes localizados en cromosomas y plásmidos, tanto monocistrónicos como localizados en operones. En base a estos antecedentes, en nuestro grupo aplicamos CRISPRi sobre el gen codificante de la proteasa LonB y sobre un gen de función desconocida en H. volcanii. LonB es una proteasa esencial para esta haloarquea y un regulador negativo de la producción de pigmentos carotenoides dado que afecta la degradación de una enzima clave de la ruta carotenogénica. Se diseñaron varios ARN guía (crRNAs) complementarios a la región promotora y sitio de inicio de transcripción, con los que se transformaron células de una cepa de H. volcanii carente de los genes cas3 y cas6b (cepa HV30). Se analizó la eficiencia del silenciamiento génico (Northern y Western blotting) y el fenotipo de lastransformantes. Para el gen lonB (HVO_0783) se obtuvieron colonias hiperpigmentadas con un incremento de al menos 5 veces en el contenido del carotenoide bacterioruberina, consistente con una represión del gen lonB cercana al 70 %.
Fil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Ferrari, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Schwarz, T. S.. Ulm University. Department of Biology II; Alemania
Fil: Marchfelder, A.. Ulm University. Department of Biology II; Alemania
V Congreso Argentino de Microbiología Agrícola Ambiental
Virtual
Argentina
Asociación Argentina de Microbiologia
Materia
CRISPRi
HALOFERAX VOLCANII
ARQUEAS
PROTEASA LONB
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
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Repositorio
CONICET Digital (CONICET)
Institución
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
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Fil: de Castro, Rosana Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
Fil: Ferrari, María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentina
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Asociación Argentina de Microbiologia
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