Cuantificación del transporte que subyace a las señales intracelulares de calcio

• Autores: Villarruel, Cecilia Liliana
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ponce Dawson, Silvina Martha
• Materia: DINÁMICA DE CALCIO; PROCESOS DE DIFUSIÓN Y REACCIÓN; ESPECTROSCOPIA POR CORRELACIÓN DE FLUORESENCIA
• Institución: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

El Ca2+ es un mensajero intracelular ubicuo. Está involucrado en la regulación de diferentes procesos, desde la fecundación hasta la muerte celular, pasando por la diferenciación celular, contracción muscular y muchos otros. La versatilidad y universalidad del Ca2+ como agente señalizador se basa en la diversidad de distribuciones espacio-temporales que su concentración puede desplegar dentro de las células. Para generar e interpretar la enorme variedad de señales de Ca2+ observadas las células cuentan con mecanismos que sensan la concentración de este ión e intervienen en su homeostasis. Se supone entonces que la información está codificada en la dinámica de la distribución de Ca2+. Una comprensión profunda de las señales requiere por lo tanto identificar las distribuciones que pueden ocurrir, cómo las mismas son moduladas por distintos factores y la respuesta final que pueden inducir en cada tipo celular específico. Una descripción abarcadora de las señales de calcio, que involucran un amplio rango de escalas espaciales y temporales, requiere necesariamente de una combinación de observación y modelado matemático. Para que esta combinación sea útil es necesario contar con valores confiables (idealmente, medidos in situ) de los parámetros biofísicos que caracterizan a los procesos que determinan la dinámica espacio-temporal del calcio intracelular. En particular, es de vital interés conocer el coeficiente de difusión del Ca2+ dentro de las células y cómo dicho transporte es afectado por la presencia de buffers (típicamente proteínas) que reaccionan con él alterando su concentración y su dinámica. La tasa de transporte intracelular del ión y la “capacidad buffering” del medio son fundamentales para determinar el alcance de las señales. Los experimentos ópticos proveen una herramienta poco invasiva para observar las señales en células intactas. Una de las técnicas ópticas ampliamente utilizada para estudiar coeficientes de difusión es la Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, Fluorescence Correlation Spectroscopy), junto con microscopía confocal. FCS utiliza el análisis estadístico de las fluctuaciones en la fluorescencia de un sistema a fin de obtener información de los procesos que generan dichas fluctuaciones. Para esto se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuaciones en la fluorescencia, la información de las escalas temporales características de los procesos subyacentes se encuentra en el decaimiento de la correlación. Sin embargo, la aplicación de esta técnica para estudiar la difusión intracelular del Ca2+ no es directa por dos motivos. En primer lugar, para estudiar al Ca2+ mediante microscopía de fluorescencia se utilizan sustancias que reaccionan con el Ca2+ y, al hacerlo, modifican sus propiedades espectrales, ya sea modificando el rango de longitudes de onda de excitación y emisión o aumentando significativamente su emisión. En segundo lugar, dentro de la célula existen sustancias, típicamente proteicas, llamadas buffers que reaccionan con el Ca2+ y modifican su tasa de transporte. Entonces el transporte de Ca2+ dentro de la célula está determinado por procesos difusivos y de reacción. Este tipo de transporte puede describirse mediante coeficientes de difusión efectivos que tienen información sobre ambos procesos. Por otro lado, para extraer información confiable de este tipo de experimentos es sumamente importante contar con un modelo adecuado para la interpretación de los datos. Usualmente, bajo ciertas aproximaciones es posible obtener expresiones analíticas para la función de autocorrelación. Dichas aproximaciones se basan en ciertos supuestos sobre los que hay que ser muy cuidadosos. En este trabajo de tesis doctoral nos centramos en la estimación de ciertos parámetros biofísicos subyacentes al transporte intracelular de Ca2+, utilizando como sistema modelo ovocitos de Xenopus laevis. En primer lugar analizamos la teoría detrás de las aproximaciones empleadas para el análisis de mediciones de FCS en sistemas similares al aquí empleado. Determinamos los límites de estas aproximaciones y qué parámetros sería posible estimar. En segundo lugar, estudiamos el coeficiente de difusión del Ca2+ y de un buffer “colectivo” en el citosol y en el lumen del retículo endoplasmático de ovocitos de X. laevis, teniendo en cuenta las consideraciones discutidas en la primer parte respecto de los modelos empleados para la interpretación de los datos.
Calcium (Ca2+) is an ubiquitous intracellular messenger. It is involved in the regulation of diverse biological processes, such as fertilization, cell diferentiation, muscle contraction, cell death, and many others. The versatility and universality of Ca2+ as a signalling agent is based on the great diversity of spatio-temporal distribution that its concentration can display inside cells. To generate and interpret the enormous variety of observed Ca2+ signals, cells employ mechanisms that sens and control Ca2+ homeostasis. It is supposed that the information is encoded in the Ca2+ distribution dynamics. A deep comprehension of calcium signals needs to identify what kind of distributions can be achieved, how they are modulated and the final answer that can be induced in each specific cell types. Calcium signals involve a wide range of spatial and temporal scales, a comprehensive description necessarily requires a combination of experiments and mathematical modeling. For this combination to be usefull, it is necessary to have reliable estimates, ideally obtained in situ, of the biophysical parameters that characterize the processes that determine the spatio-temporal dynamic of intracellular calcium. In particular, it is key to know the Ca2+ coefficient diffusion inside cells and how its transport is affected by the presence of buffers, tipically protein, that react with Ca2+ modifying its transport and concentration. The intracellular transport rate of Ca2+ and the buffering capacity of the media are fundamental to determine the extent of the signals. Optical techniques have provided a non-invasive means to study intracellular calcium signals in intact cells. Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) in combination with confocal microscopy is an optical technique that have been widely used to estimate diffusion coefficients. FCS uses statistical analysis of the fluctuations of fluorescence in a system in order to derive information of the processes underlying such fluctuations. To this end, the autocorrelation function (ACF) of fluctuation v in fluorescence is computed, the decay of the correlation carries information on the characteristic time scales of the underlying biophysical processes. However, the direct application of this technique to the case of Ca2+ transport in intact cells is not completely straightforward for two reason. In one hand, the observation of Ca2+ is by means of fluorophores that react with Ca2+ and changes their spectral properties upon binding, by an increase in fluorescence intensity of fluorescence or emission/excitation wavelength shift. On the other hand, inside cells there are Ca2+ buffers, tipically protein, that react with Ca2+ modifying its transport rate. Hence, Ca2+ transport inside cell is determined by diffusionreaction processes. This situation can be described by effective diffusion coefficients that have information about the two processes. To extract reliable information from these optical experiments it is extremely important to have an appropriate model for the interpretation of the data. Normally, analytic expressions for the autocorrelation function can be obtained under certain approximations. These approximations are based on certain assumptions with which it is necessary to be very careful. The aim of this Thesis has been to study and estimate certain biophysical paramters underlying intracellular Ca2+ transport, with Xenopus laevis oocytes as a model system. First of all, we analized the theory under the approximations normally used for the analysis of FCS experiments in systems similar to ours. We determined the limits of such approximations and what parameters could be estimated. In second place, we studied the difffusion coefficient of Ca2+ and a collective buffer in X. laevis oocytes citosol and lumen of the endoplasmic reticulum, considering the discussion of the first section about the models for data interpretation.
Fil: Villarruel, Cecilia Liliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Autor;