Análisis fenotípico y funcional de linfocitos B de memoria y productores de anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi en la enfermedad de Chagas

• Autores: César, Gonzalo Leandro
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Laucella, Susana Adriana
• Materia: PLASMABLASTOS; CELULAS B; CELULAS B DE MEMORIA; T. CRUZI; CELULAS SECRETORAS DE ANTICUERPOS; PLASMABLAST; B CELLS; MEMORY B CELLS; T. CRUZI; ANTIBODY SECRETING CELLS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana) es la enfermedad parasitaria de mayor impacto en América Latina y un problema de salud creciente en países no endémicos debido alos flujos migratorios. Una gran limitación para evaluar la eficacia el tratamiento conbenznidazol es la falta de pruebas diagnósticas que muestren a corto plazo los efectos deltratamiento. Los ensayos de serología convencional requieren un largo tiempo de seguimientopara observar la negativización completa, algo que ocurre en alrededor de un 30% de lospacientes tratados. Se desconoce si los anticuerpos que se detectan en la circulación de los pacientes con infección crónica provienen de células B vírgenes o linfocitos B de memoria que se diferencian continuamente a plasmablastos ante la persistencia del parásito o de linfocitos de larga vida que pueden persistir aún en ausencia del antígeno que le dieron origen. La presencia de linfocitos B de larga vida alojados en médula ósea o ganglios linfáticos podría enmascarar la desaparición de plasmablastos dependientes de la presencia de antígeno luego del tratamiento específico. En este trabajo nos propusimos medir los niveles de linfocitos B secretores de anticuerpos y células B de memoria específicas para T. cruzi y totales en la circulación de pacientes adultos y pediátricos con enfermedad de Chagas crónica mediante el ensayo de ELISPOT previamente a recibir el tratamiento con benznidazol y a distintos tiempos postratamiento. Los cambios en las poblaciones de linfocitos B se correlacionaron con la evolución serológica de los pacientes medida por técnicas de serología convencional y no convencionales. Mediante un método de tinción por citometría de flujo que utiliza proteínas recombinantes de T. cruzi marcadas con fluorocromos como "cebos", analizamos el fenotipo de las células B específicas para T. cruzi. Finalmente, se evaluó la capacidad funcional de las diferentes subpoblaciones de linfocitos B totales en la circulación de pacientes con distinto grado de disfunción cardíaca. La mayoría de los individuos infectados con T. cruzi presentaron CSAs (plasmablastos) específicos para un lisado de T. cruzi en su circulación, y estas células desaparecieron luego del tratamiento con benznidazol sólo en aquellos pacientes que mostraron una disminución de los niveles de anticuerpos indicativos de eficacia (ya sea negativización completa de la serología o caída significativa de títulos), pero no en aquellos pacientes con títulos serológicos inalterados. Con respecto a los niveles de células B de memoria, estos fueron bajos, ya sea antes, así como después del tratamiento. La disminución en los niveles de células secretoras de anticuerpos específicos para T. cruzi se correlación con la disminución en los niveles de anticuerpos medidos por el ensayo de multiplex y precedió la disminución de anticuerpos medidos por serología convencional. Las células B específicas para las proteínas recombinantes de T. cruzi se componen principalmente de células de memoria atípicas, células vírgenes en reposo y plasmablastos. Del análisis del fenotipo B total observamos una distribución anormal de células B en individuos con enfermedad crónica, particularmente un aumento en la frecuencia de células B de memoria atípicas y plasmablastos tanto en adultos como en niños infectados con T. cruzi. El tratamiento con benznidazol logró restaurar un fenotipo similar al observado en personas no infectadas. En el análisis funcional observamos que existe una disfunción en la producción de citocinas inflamatorias en los pacientes con compromiso cardíaco avanzado Particularmente pudimos ver que, luego de la estimulación policlonal, las células B de memoria atípica presentan poca capacidad para secretar IL-6 y TNF-α, mientras que observamos que la mayor producción de citocinas se da por parte de células B vírgenes activadas y células B CD27+CD21+HLADR+ que probablemente corresponda a un fenotipo de memoria previo a la activación y perdida de la molécula CD21. Estos hallazgos en conjunto muestran la viabilidad de detectar células B específicas para T. cruzi en la fase crónica de la enfermedad de Chagas. La lenta caída en los niveles de anticuerpos específicos para el parásito luego del tratamiento puede deberse a la presencia de linfocitos B de larga vida confirmando la hipótesis de esta tesis. La infección crónica también induciría alteraciones en la diferenciación y función de células B. El seguimiento de CSAs específicas para el parásito serviría como una herramienta útil para determinar la eficacia de tratamiento en protocolos de ensayos clínicos [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].
Chagas disease (American trypanosomiasis) is the parasitic disease with the greatest health impact in Latin America and a growing health problem in non-endemic countries due to migratory flows. A major limitation for the evaluation of the efficacy of treatment with benznidazole in the chronic phase of Trypanosoma cruzi infection is the lack of reliable tools for assessing treatment outcome in the short term. Complete conversion to negative serology using standard tests can take more than 10 years and is achieved in less than 40% of treated subjects. It is unknown whether the antibodies detected in the circulation of chronically infected subjects derive from naïve B cells or memory B lymphocytes that continually differentiate into plasmablasts in the phase of parasite persistence, or from long-lived plasma cells that persist for a long time in the absence of antigen. Because plasmablasts are rarely present in the circulation in the absence of antigen or of viable replicating pathogens, measurement of T. cruzi-specific plasmablasts after anti-parasite treatment could provide a rapid assessment of treatment efficacy relative to the measurement of T. cruzi-specific antibodies, whose decay can be masked by antigen-independent persistence of antibodies derived from long-lived plasma cells. In this work we propose to measure the levels of antibody-secreting B lymphocytes and memory B cells in the circulation of adult and pediatric patients with chronic Chagas disease using the ELISPOT assay prior to receiving treatment with benznidazole and at different post-treatment times. The changes in the B lymphocyte populations were correlated with the serological outcome of treatment measured by conventional and unconventional serologic techniques. Using a flow cytometry staining method and fluorochrome-labeled recombinant T. cruzi proteins as "baits," we analyzed the phenotype of T. cruzi-specific B cells. Finally, the functional capacity of the different subpopulations of B lymphocytes in the circulation of patients with different degrees of cardiac dysfunction was evaluated. Most individuals infected with T. cruzi had antibody-secreting cells (i.e., plasmablasts) specific for a T. cruzi lysate in their circulation, and these cells disappeared after benznidazole treatment only in those patients who showed decreased levels of parasite-specific antibodies (either complete negativization of serology or a significant decay of titers), but not in those patients with unaltered antibody levels. T. cruzi-specific memory B cells generally exhibited lower prevalence prior to treatment in adults and children and these levels did not improve after therapy regardless of treatment outcome. In subjects with declining serology (i.e., regarded as successful treatment outcome), the decay in antibody secreting B cells correlated with the decrease in T. cruzi-specific antibodies using the multiplex technique and preceded the decline in antibody levels by conventional serologic tests. B cells specific for T. cruzi recombinant proteins are mainly comprised of atypical memory cells, resting naïve cells, and plasmablasts. An abnormal distribution of total B cells, particularly an increase in the frequency of atypical memory B cells and plasmablasts in both adults and children infected with T. cruzi was observed prior to treatment and the phenotype returned to a non-infection profile after successful treatment. After polyclonal stimulation, atypical memory B cells had a low capacity to secrete IL-6 and TNF-α, while activated naïve B cells and CD27+CD21+HLADR+ B cells had the highest capacity to produce inflammatory cytokines. Taken together, these findings show the feasibility of detecting T. cruzi-specific B cells in the chronic phase of Chagas disease. The slow decrease in the levels of parasite-specific antibodies after treatment may be due to the presence of long-lived B plasma cells confirming the hypothesis of this thesis. Chronic T. cruzi infection also induced alterations in B-cell differentiation and function. Monitoring of parasite specific antibody-secreting cells would serve as a useful tool to determine treatment efficacy in clinical trial protocols [fórmula aproximada, revisar la misma en el original].
Fil: César, Gonzalo Leandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.