Reducción del pardeamiento enzimático en papa (Solanum tuberosum L.) mediante edición génica con el sistema CRISPR/Cas9

• Autores: González, Matías Nicolás
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Feingold, Sergio Enrique; Massa, Gabriela Alejandra
• Materia: CRISPR/CAS9; PAPA; SOLANUM TUBEROSUM; EDICION GENICA; PARDEAMIENTO ENZIMATICO; POLIFENOL OXIDASA; PROTOPLASTOS; AGROBACTERIUM TUMEFACIENS; MEJORAMIENTO VEGETAL; ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO; CRISPR/CAS9; POTATO; SOLANUM TUBEROSUM; GENOME EDITING; ENZYMATIC BROWNING; POLYPHENOL OXIDASE; AGROBACTERIUM TUMEFACIENS; PLANT BREEDING; GENETICALLY MODIFIED ORGANISM
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El pardeamiento enzimático es causado por la actividad de las polifenol oxidasas (PPO), enzimas que catalizan la conversión de compuestos fenólicos en quinonas, conllevando a la formación de complejos oscuros en los vegetales. Esto produce cambios indeseables en las propiedades organolépticas y la pérdida de valor nutricional de los mismos y sus productos derivados. En papa (Solanum tuberosum L.), las PPO están codificadas por una familia génica, dentro de la cual el gen StPPO2 codifica para una enzima de alta concentración y actividad en los tubérculos. En esta tesis se estudió la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 (del inglés clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR associated protein 9) como herramienta para la reducción del pardeamiento enzimático en tubérculos de papa, a través de la edición del gen StPPO2. Uno de los pasos clave para el uso de esta tecnología es su introducción en la célula vegetal y la subsecuente regeneración de plantas editadas. En la primera parte de esta tesis se compararon tres aproximaciones, basadas en la transformación con un vector binario (CR-PPO) mediada por Agrobacterium tumefaciens, la expresión transitoria de CR-PPO en protoplastos y la transfección de protoplastos con complejos de ribonucleoproteína (RNP-PPO) para mediar la edición de StPPO2, obteniéndose eficiencias de edición de 9,6%, 31,9% y 18,4%, respectivamente. A su vez, solo la expresión transitoria de CR-PPO en protoplastos resultó en líneas editadas en los cuatro alelos de StPPO2, observado en el 46% de las líneas editadas. Estos resultados demostraron que la eficiencia de edición y los genotipos resultantes dependen, al menos en parte, de la aproximación utilizada para la introducción de los componentes de CRISPR/Cas9. Con fines de mejoramiento, una aproximación que evite la inserción de ADN foráneo puede resultar en plantas indistinguibles de las producidas por cruzamiento convencional o mutagénesis. En la segunda parte de esta tesis se obtuvieron nuevos complejos de ribonucleoproteína (RNP) para su transfección en protoplastos. Dependiendo de las condiciones de transfección, la eficiencia de edición varió entre 28% y 68%, obteniéndose entre 5% y 42% de líneas editadas en los cuatro alelos de StPPO2. En este último grupo se comprobó la ausencia de edición en otros genes codificantes para PPO. Los tubérculos de estas líneas mostraron reducciones de hasta un 69% de la actividad de PPO y de hasta un 74% en el pardeamiento enzimático. Estos resultados demostraron que CRISPR/Cas9 puede ser aplicado al desarrollo de variedades de papa con reducción del pardeamiento enzimático, a partir de la edición específica de un único miembro de la familia StPPO. En la última parte de esta tesis, se seleccionó la línea editada M08001, para una caracterización molecular y fenotípica más detallada, y para el análisis de su estatus según el marco regulatorio de Argentina. La secuenciación de sitios genómicos potencialmente reconocidos por CRISPR/Cas9 permitió descartar la ocurrencia de cambios en regiones inespecíficas. A su vez, esta línea mostró una reducción significativa de la expresión del gen StPPO2 en tubérculo, lo que explicaría al menos en parte la reducción observada en la actividad de PPO. El cultivo de M08001 en condiciones de invernáculo demostró que la edición del gen StPPO2 no afectó el normal crecimiento y desarrollo de la planta, ni el rendimiento de los tubérculos. Estos resultados fueron confirmados mediante el análisis de caracteres morfológicos en un ensayo a campo. Finalmente, el análisis de su estatus regulatorio por parte de los organismos competentes determinó que M08001 no es considerada un organismo genéticamente modificado (OGM), lo que indica que podrá ser registrada como nueva variedad en nuestro país siguiendo la normativa que aplica a aquellas obtenidas por mejoramiento convencional. En conjunto, los resultados de esta tesis hacen una importante contribución tanto a aspectos técnicos de la aplicación de CRISPR/Cas9 en papa, como al estudio de un carácter crítico relacionado con la calidad post-cosecha de este cultivo. Asimismo, representa un paso determinante hacia el establecimiento de un nuevo método de mejoramiento para el desarrollo de variedades con potencial uso comercial en nuestro país y en otros.
Enzymatic browning is a consequence of polyphenol oxidases (PPO) activity, which catalyzes the conversion of phenolic substrates to quinones, leading to the formation of dark-colored precipitates in vegetables. This process causes undesirable changes in organoleptic properties and diminishes the nutritional value of fresh and derived products. In potato (Solanum tuberosum L.), PPOs are encoded by a multi-gene family, with StPPO2 gene responsible for most of the PPO content and activity in tubers. In this thesis, the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR associated protein 9) system was applied to induce StPPO2 gene editing in order to obtain potato tubers with reduced enzymatic browning. Delivery of the CRISPR/Cas9 components to the plant cell and further regeneration of edited lines are key steps in the use of this technology. In the first part of this thesis, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation with a binary vector (CR-PPO), CR-PPO transient expression in protoplasts, and ribonucleoprotein complexes (RNP-PPO) transfection in protoplasts were compared to mediate StPPO2 gene editing, with editing efficiencies yielding 9.6%, 31.9% and 18.4%, respectively. Furthermore, only the CR-PPO transient expression in protoplasts resulted in lines edited in all four StPPO2 alleles, observed in 46% of the edited lines. These results demonstrated that genome editing efficiency and outcomes depend, at least partially, on the CRISPR/Cas9 delivery approach in potato. For breeding applications, a delivery approach that avoids foreign DNA insertions would result in plants indistinguishable from those obtained through conventional breeding or mutagenesis. In the second part of this thesis, new ribonucleoprotein complexes (RNP) were designed and transfected to potato protoplasts. According to the transfection conditions, StPPO2 gene editing efficiency varied between 28% and 68%, with 5 to 42% of the edited lines modified in all four alleles of the target gene. In addition, no off-target editing was identified in other analyzed StPPO genes. Lines edited in all four alleles of StPPO2 gene produced tubers with a reduction of up to 69% in PPO activity and a reduction of 74% in enzymatic browning. These results demonstrated that the CRISPR/Cas9 system could be applied to develop potato varieties with reduced enzymatic browning in tubers, by the specific editing of a single member of the StPPO gene family. Finally, the edited line M08001 was selected for further molecular and phenotypic analyses, as well as to determine its regulatory status according to Argentinean legislation. Sequencing analysis of genomic sites potentially recognized by the CRISPR/Cas9 system, confirmed the absence of unwanted off-target modifications. In addition, this line exhibited a substantial reduction of StPPO2 gene expression in tubers, which could explain, at least partially, the reduction in the total PPO activity in that tissue. M08001 grown in greenhouses showed no abnormalities in plant or tuber growth and development. These results were confirmed through morphologic characterization during a field trial. The analysis of the regulatory status by the competent authorities determined that M08001 is not considered a genetically modified organism (GMO), which allows registration as a new potato variety in Argentina, following the same regulatory requirements of a variety obtained by conventional breeding. Altogether, this thesis makes a substantial contribution to practical aspects of CRISPR/Cas9 applications in potato, and to the study of an important post-harvest quality trait. Moreover, this thesis represents a step towards establishing a new breeding tool for the development of improved potato varieties with commercial potential in Argentina and elsewhere.
Fil: González, Matías Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.