Reducción del pardeamiento enzimático en papa (Solanum tuberosum L.) mediante edición génica con el sistema CRISPR/Cas9 - González, Matías Nicolás (2021)
El pardeamiento enzimático es causado por la actividad de las polifenol oxidasas (PPO), enzimas que catalizan la conversión de compuestos fenólicos en quinonas, conllevando a la formación de complejos oscuros en los vegetales. Esto produce cambios indeseables en las propiedades organolépticas y la pérdida de valor nutricional de los mismos y sus productos derivados. En papa (Solanum tuberosum L.), las PPO están codificadas por una familia génica, dentro de la cual el gen StPPO2 codifica para una enzima de alta concentración y actividad en los tubérculos. En esta tesis se estudió la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 (del inglés clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR associated protein 9) como herramienta para la reducción del pardeamiento enzimático en tubérculos de papa, a través de la edición del gen StPPO2. Uno de los pasos clave para el uso de esta tecnología es su introducción en la célula vegetal y la subsecuente regeneración de plantas editadas. En la primera parte de esta tesis se compararon tres aproximaciones, basadas en la transformación con un vector binario (CR-PPO) mediada por Agrobacterium tumefaciens, la expresión transitoria de CR-PPO en protoplastos y la transfección de protoplastos con complejos de ribonucleoproteína (RNP-PPO) para mediar la edición de StPPO2, obteniéndose eficiencias de edición de 9,6%, 31,9% y 18,4%, respectivamente. A su vez, solo la expresión transitoria de CR-PPO en protoplastos resultó en líneas editadas en los cuatro alelos de StPPO2, observado en el 46% de las líneas editadas. Estos resultados demostraron que la eficiencia de edición y los genotipos resultantes dependen, al menos en parte, de la aproximación utilizada para la introducción de los componentes de CRISPR/Cas9. Con fines de mejoramiento, una aproximación que evite la inserción de ADN foráneo puede resultar en plantas indistinguibles de las producidas por cruzamiento convencional o mutagénesis. En la segunda parte de esta tesis se obtuvieron nuevos complejos de ribonucleoproteína (RNP) para su transfección en protoplastos. Dependiendo de las condiciones de transfección, la eficiencia de edición varió entre 28% y 68%, obteniéndose entre 5% y 42% de líneas editadas en los cuatro alelos de StPPO2. En este último grupo se comprobó la ausencia de edición en otros genes codificantes para PPO. Los tubérculos de estas líneas mostraron reducciones de hasta un 69% de la actividad de PPO y de hasta un 74% en el pardeamiento enzimático. Estos resultados demostraron que CRISPR/Cas9 puede ser aplicado al desarrollo de variedades de papa con reducción del pardeamiento enzimático, a partir de la edición específica de un único miembro de la familia StPPO. En la última parte de esta tesis, se seleccionó la línea editada M08001, para una caracterización molecular y fenotípica más detallada, y para el análisis de su estatus según el marco regulatorio de Argentina. La secuenciación de sitios genómicos potencialmente reconocidos por CRISPR/Cas9 permitió descartar la ocurrencia de cambios en regiones inespecíficas. A su vez, esta línea mostró una reducción significativa de la expresión del gen StPPO2 en tubérculo, lo que explicaría al menos en parte la reducción observada en la actividad de PPO. El cultivo de M08001 en condiciones de invernáculo demostró que la edición del gen StPPO2 no afectó el normal crecimiento y desarrollo de la planta, ni el rendimiento de los tubérculos. Estos resultados fueron confirmados mediante el análisis de caracteres morfológicos en un ensayo a campo. Finalmente, el análisis de su estatus regulatorio por parte de los organismos competentes determinó que M08001 no es considerada un organismo genéticamente modificado (OGM), lo que indica que podrá ser registrada como nueva variedad en nuestro país siguiendo la normativa que aplica a aquellas obtenidas por mejoramiento convencional. En conjunto, los resultados de esta tesis hacen una importante contribución tanto a aspectos técnicos de la aplicación de CRISPR/Cas9 en papa, como al estudio de un carácter crítico relacionado con la calidad post-cosecha de este cultivo. Asimismo, representa un paso determinante hacia el establecimiento de un nuevo método de mejoramiento para el desarrollo de variedades con potencial uso comercial en nuestro país y en otros.