Establecimiento y estudio in vitro de células madre/progenitoras tumorales derivadas de gliomas de alto grado como fuente renovable para desarrollos terapéuticos

• Autores: Videla Richardson, Guillermo Agustín
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Scassa, María Elida
• Materia: GLIOMA; GLIOBLASTOMA MULTIFORME; CELULAS MADRE TUMORALES; PROGENITORES TUMORALES; CD133; MULTIPOTENCIA; BMP4; EGF; BFGF; ENDOTELINAS; GLIOMA; GLIOBLASTOMA MULTIFORME; CANCER STEM CELLS; TUMOUR PROGENITOR CELLS; CD133; MULTIPOTENCY; BMP4; EGF; BFGF; ENDOTHELINS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los gliomas de alto grado son los tumores cerebrales primarios más frecuentes y son altamente agresivos e invasivos. Éstos parecen exhibir una organización jerárquica y se ha postulado que su generación ocurre a partir de células madre tumorales (CMT), las cuales corresponderían a una subpoblaciónminoritaria capaz de generar y propagar tumores al ser inyectadas en ratones inmunodeficientes. De esta forma, el aislamiento y la caracterización de células tumorales derivadas de pacientes con fenotipo de células madre o progenitoras permite contar con un valioso modelo de estudio para comprender en mayor profundidad la biología de los gliomas. En el presente trabajo logramos establecer con éxito nueve líneas decélulas madre/progenitoras tumorales (CMPT) a partir de biopsias de gliomas dealto grado. Éstas fueron capaces de generar tumores luego de ser inyectadas enel sistema nervioso central en ratones inmunodeficientes y presentaron lasmismas alteraciones genéticas que se encontraron en los tumores parentales. Además, todas ellas fueron positivas para los marcadores de CMT: Nestina, Vimentina, CD44 y Sox2. Sin embargo, el grado de expresión de CD133 resultóser variable en todas las líneas analizadas. A pesar de las similitudes entre las CMPT y las células madre neurales, esconcebible pensar que pueden existir diferencias en sus respectivos potencialesde diferenciación. Para responder este interrogante hemos sometido a estaslíneas celulares a diversos protocolos de diferenciación basados principalmente enel agregado de BMP4 recombinante humano y en la deprivación de factores decrecimiento. Luego de analizar la expresión de distintos marcadores de diferenciación y de evaluar cambios en la morfología celular, determinamos queestas líneas de CMPT poseen un grado variable de multipotencia, en donde cadauna de ellas presenta un grado de compromiso particular hacia los linajesastroglial y neuronal. Además, pudimos observar que la adición de BMP4 recombinante redujo marcadamente la tasa de proliferación de todas las líneascelulares estudiadas. Por último, hemos determinado los niveles de expresión del ARNm de distintos ligandos y receptores involucrados en la señalizacióndependiente de BMPs en seis líneas de CMPT, encontrando en ellas ciertospatrones de expresión característicos. Dado que las CMT probablemente dependan de determinadas señales delmicroambiente tumoral para mantener su identidad, un tratamiento efectivo podríabasarse en el bloqueo de mediadores generados en el nicho perivascular. Por estemotivo y dado el gran potencial de este modelo experimental para el testeo dedrogas, decidimos estudiar los niveles de expresión de los ARNm de loscomponentes del eje endotelinérgico en diferentes líneas de CMPT. Pudimosobservar que todas las líneas celulares analizadas mostraron una expresiónelevada de los transcriptos del receptor ETRB, mientras que el grado de expresiónde los componentes restantes del sistema fue dependiente de cada línea celular. Más aún, en dos de cuatro líneas analizadas, el agregado de endotelinasrecombinantes produjo una disminución significativa de los niveles de apoptosisgenerados en condiciones de deprivación de factores de crecimiento y nutrientes. Dada la variabilidad observada en las respuestas celulares a diferentestratamientos en las distintas líneas de CMPT, este trabajo pone de menifiesto larelevancia de contar con un modelo in vitro basado en cultivos derivados degliomas que permita contribuir al desarrollo de terapias personalizadas.
High grade gliomas are the most frequent and malignant primary braintumors in adults and appear to have a hierarchical organization suggestive of astem cell foundation. Glioma stem cells (GSC) have been recently isolated fromtumors of patients and were characterized as a small subset of stem-like tumorcells capable of initiating and sustaining tumor growth when grafted into mice. Thus, isolation and expansion of these putative cancer stem/progenitor cells,harboring tumor-specific phenotypes, constitutes a powerful model to study gliomabiology. Significantly, GSC lines from different tumors exhibit divergent geneexpression signatures and distinct differentiation behavior. In the present study, we successfully established nine gliomastem/progenitor cell (GSPC) lines obtained from malignant gliomas which displaystem cell properties and initiate high-grade gliomas following xeno transplantation. Importantly, all the established cell lines presented the same genomic alterationsas parental tumors. Additionally, they were all positive for the stem cell markers: Nestin, Vimentin, CD44 and Sox2. In contrast, CD133 expression levels widelyvaried among GSPC lines. Despite similarities between GSPC and normal neural stem cells, wehypothesized that there may be differences in their differentiation potentials. Toaddress this issue, first, we exposed these cell lines to several differentiationconditions that principally include BMP4 treatment and growth factors withdrawal. After analyzing the expression of various markers of differentiation and assessingchanges in cell morphology, we determined that these GSPC lines possess avarying degree of multipotency. Moreover, we observed that the addition of recombinant BMP4 markedly reduced the rate of proliferation of all the studied celllines. Finally, we determined the expression levels of different ligands andreceptors involved in BMP-signaling, and found that the GSPC lines showcharacteristic patterns of expression. As many cancer stem cells might depend on a niche to maintain theiridentity, targeting molecules triggered by the perivascular niche could be a strategyto deplete or differentiate them. For this reason and given the potential of thepresent experimental model for drug screening, we studied the expression profileof the endothelin (EDN) axis members in different GSPC lines grown in vitro. Ourfindings revealed that all tested cell lines robustly express ETRB receptor. Nevertheless, the expression levels of the other components of this axis resultedcell line specific. Furthermore, in two from four GSPC lines, the addition ofrecombinant EDNs (1, 2 and 3) reduced apoptotic rates upon qrowth factors andnutrients withdrawal. Given the diversity of the responses displayed by patient-derived CSC lines,the present study highlights the relevance of the in vitro model presented herein forthe development of tailor-made therapies.
Fil: Videla Richardson, Guillermo Agustín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.