Identificación de componentes tempranos de la transducción de señales lumínicas en Arabidopsis thaliana a través del uso de técnicas de fosfoproteómica.

• Autores: Arico, Denise Soledad
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Mazzella, María Agustina; Wengier, Diego Leonardo
• Materia: FOSFOPROTEOMA; FOTOTRANSDUCCION DE SEÑALES; COP1-INTERACTING-PROTEIN 7; MICROTUBULOS; PHOSPHOPROTEOME; LIGHT SIGNALING TRANSDUCTION; COP1-INTERACTING-PROTEIN 7; MICROTUBULES
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las modificaciones post-traduccionales proveen mecanismos de respuestas rápidas frente a estímulos en contraste con la reprogramación génica que ocurre en una mayor escala temporal. La fosforilación es una modificación frecuente en la transducción de señales lumínicas en plantas. Con el objetivo de identificar aquellas proteínas cuyo estado de fosforilación cambia en respuesta a la luz, se llevó a cabo un estudio a gran escala de LC-MS/MS sobre el fosfoproteoma de plántulas etioladas de Arabidopsis thaliana inducidas por luz a tiempos cortos. Logramos identificar 37 proteínas cuyo estado de fosforilación cambia con la luz. Dado nuestro interés en la transducción de señales mediadas por fotorreceptores, nos enfocamos en 5 de estas proteínas cuya fosforilación es regulada por luz y dependiente de fotorreceptores. Una de ellas es CIP7 (“COP1-INTERACTING PROTEIN 7”), una proteína descripta en un único reporte como un factor de transcripción de localización nuclear que interacciona con el represor de la fotomorfogénesis COP1 (“CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENESIS 1”), y cuyo transcripto es inducible por luz. En nuestro ensayo, la Serina 915 de CIP7 sufre una desfosforilación inducida por luz en presencia de al menos alguno de los cuatro fotorreceptores más importantes durante la desetiolacion de plántulas (fitocromo A, fitocromo B, criptocromo 1 y/o criptocromo 2). Para estudiar si CIP7 participa en eventos tempranos de fotomorfogénesis, llevamos adelante su caracterización funcional y fisiológica. Reporteros transcripcionales pCIP7::GUS en plántulas etioladas de 5 días, revelaron que el promotor de CIP7 es activo en oscuridad en cotiledones y zonas de elongación de hipocotilo y raíz. Estos ensayos junto con resultados de experimentos RT-qPCR mostraron que la exposición prolongada a la luz inhibe la expresión de CIP7. Análisis de co-localización, revelaron que CIP7-YFP se localiza en microtúbulos corticales. También observamos que mutantes por CRISPR-Cas9 de CIP7 pierden la capacidad de elongar el hipocotilo en oscuridad. Estos resultados difieren de aquel anteriormente propuesto y sugieren que CIP7 sería un promotor del crecimiento del hipocotilo en oscuridad mediante la regulación de la dinámica de microtúbulos.
Post-translational modifications provide rapid response mechanisms against stimuli in contrast to gene reprogramming that occurs on a larger time scale. Phosphorylation is a frequent modification during the phototransduction in plants. In order to identify those proteins whose phosphorylation status changes in response to light, a large-scale study of LC-MS/MS was carried out on the early light-induced phosphoproteome of Arabidopsis thaliana etiolated seedlings. We identified 37 proteins that significantly change their phosphorylation state with light. Given our interest in signal transduction mediated by photoreceptors, we focused on 5 of these proteins whose phosphorylation is regulated by light and dependent on photoreceptors. One of them is CIP7 (COP1-interacting protein 7), a protein described in a single report as a nuclear transcription factor that interacts with the COP1 photomorphogenesis repressor (Constitutive photomorphogeneseis 1), and whose transcript is light inducible. In our experiments, CIP7 presents a phospho-site, Serine 915, that undergoes a light-induced dephosphorylation in the presence of at least one of the four most important photoreceptors during seedling de-etiolation (phytochrome A, phytochrome B, cryptochrome 1 and/or cryptochrome 2). To study whether CIP7 participates in early photomorphogenesis events, we carried out its functional and physiological characterization. pCIP7p::GUS transcriptional reporters in 5-day etiolated seedlings, revealed that the CIP7 promoter is active in the dark, in cotyledons as well as hypocotyl and root elongation areas. These experiments supported by RT-qPCR assays showed that prolonged exposure to light inhibits the expression of CIP7. Co-localization analysis revealed that CIP7-YFP is located in cortical microtubules. We also observed that CRISPR-Cas9 cip7 mutant lines lose the ability to elongate the hypocotyl in the dark. These results differ from those that were previously reported and suggest that CIP7 would be a promoter of hypocotyl growth in darkness by regulating microtubule dynamics.
Fil: Arico, Denise Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.