Estudio de Lumazina Sintasa de Brucella como proteína transportadora de antígenos : relación entre estructura, estabilidad e inmunogenicidad

• Autores: Ainciart, Natalia
• Año de publicación: 2011
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Goldbaum, Fernando A.
• Materia: BRUCELLA ABORTUS; LUMAZINA SINTASA; DENSIDAD DE EPITOPES; ESTRUCTURA; ESTABILIDAD; INMUNOGENICIDAD; ANTIGENO; BRUCELLA ABORTUS; LUMAZINE SYNTHASE; EPITOPE DENSITY; STRUCTURE; STABILITY; IMMUNOGENICITY; ANTIGEN
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La proteína lumazina sintasa de Brucella abortus (BLS) tiene características estructurales, de estabilidad y de inmunogenicidad que la convierten en un candidato interesante para su utilización como carrier o proteína transportadora de distinto tipo de moléculas (péptidos, dominios proteicos, azúcares, etc) BLS tiene una estructura de dímero de pentámero en solución y los estudios realizados en el laboratorio establecieron que tiene una temperatura de melting aparente de 89 °C y un ΔG de desnaturalización de 320 ± 22 kJ/mol. Además, genera una alta respuesta tanto celular como humoral cuando la proteína recombinante es administrada en ratones o conejos (inclusive sin adyuvante) o como vacuna a DNA en un vector de expresión eucariota. La fusión de distintos péptidos y dominios proteicos en su extremo amino terminal da lugar a quimeras de BLS y permite utilizarla como proteína transportadora y aumentar la inmunogenicidad contra las moléculas transportadas en distintos modelos animales. BLS se disocia en dos pentámeros plegados cuando es incubada con cloruro de guanidinio 2M o en buffer fosfato a pH 5. Si la concentración de desnaturalizante aumenta por encima de 2,3 M, se produce una disociación y desnaturalización concertadas que dan lugar a monómeros desplegados. Conocer en detalle estos equilibrios nos permitió diseñar dos estrategias para obtener proteínas mixtas de BLS que contuvieran una mezcla de péptidos provenientes de dos quimeras diferentes. Obtuvimos proteínas mixtas con diferente cantidad de péptido OMP31 y pudimos establecer una relación lineal entre la inmunogenicidad y la densidad de epitopes en la presentación antigénica. Al mismo tiempo, obtuvimos mutantes de estabilidad de BLS y estudiamos el efecto que tiene la estabilidad de la proteína transportadora en la inmunogenicidad contra el péptido transportado. Mediante el estudio de este modelo pudimos establecer que la densidad local de epitopes que se consigue con las quimeras de BLS y las elevadas estabilidad e inmunogenicidad intrínseca de BLS son las principales características que hacen que esta proteína funcione tan eficientemente como carrier de moléculas.
The enzyme lumazine synthase from Brucella spp. is highly immunogenic. This decameric protein is remarkably stable to thermal or chemical denaturation, suggesting a correlation between thermodynamic stability, polymeric arrangement and immunogenicity. The three-dimensional structure of this protein shows that is possible to insert foreign peptides or full-length proteins at the amino terminus without disrupting its general folding. These peptides are presented to the immune system in a polymeric way and in the context of a high specific immune response. BLS is a dimer of pentamers in solution, has a melting temperature of 89 °C and a ΔG of denaturation of 320 ± 22 kJ/mol. BLS induces a high humoral and cellular response when the recombinant protein is inoculated in mice and rabbits (even in the absence of adjuvants) or when is used as a DNA vaccine in an eukaryotic expression vectors. The decoration with peptides or protein domains (chimeras) show that of BLS acts as an efficient carrier and enhances the immunogenicity against the transported molecules. BLS dissociates into two folded pentamers when is incubated in 2 M guanidinium chloride in phosphate buffer at pH 5. Guanidinium chloride concentrations above 2.3 M produce a concerted dissociation and denaturation process resulting in unfolded monomers. The knowledge of these equilibria allowed us to design two different strategies to obtain mixed proteins of BLS with peptides from different chimeras. We obtained mixed chimeras decorated with different number of OMP31 peptides and established a linear relationship between the immunogenicity against the peptide and the epitope density. At the same time, we obtained mutants of BLS with decreased stability and studied the effect of the stability of the carrier protein in the immunogenicity of the peptide. This experimental model allowed us to demonstrate that the local density of epitopes and the high stability and intrinsic immunogenicity of BLS are the main features that make BLS an efficient carrier for vaccine design.
Fil: Ainciart, Natalia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.