Influencia de la fosforilación dependiente de PKA sobre la conformación y función de la GTPasa Rap 1b

• Autores: Edreira, Martín Miguel
• Año de publicación: 2009
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Altschuler, Daniel Leonardo
• Materia: AMPC; PKA; FOSFORILACION; EPAC; RAP 1B; ALOSTERIC EFFECT; CAP1; CAMP; PKA; PHOSPHORYLATION; EPAC; RAP 1B; ALOSTERIC EFFECT; CAP1
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La activación de Rap1b por la proteína de intercambio activada por AMPc (Epac) y sufosforilación mediada por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), son requeridas parala mitogénesis dependiente de AMPc. Sin embargo, el rol de la fosforilación permanece incierto. Evaluamos potenciales cambios conformacionales inducidos por la fosforilación de Rap1b, utilizando el intercambio hidrogeno/deuterio acoplado a espectroscopia de masa (DXMS)y cristalografía. Velocidades de intercambio hidrogeno/deuterio para Rap1b fosforilada (Rap1-P)y fosfomimética (Rap1-D) mostraron un perfil de intercambio idéntico, con velocidadesincrementadas en regiones discretas a lo largo de la proteína, incluyendo un dominio alrededordel sitio de fosforilación y la región efectora. La estructura cristalina de Rap1b-G12V-S179Dmostró que la presencia del S179D induce cambios en la interfase con los switch I y II. Nuestro segundo objetivo fue la búsqueda de efectores de Rap1b modulados porfosforilación. Entre los clones aislados por doble hibrido, se encontró la proteína asociada a la adenilil ciclasa 1 (CAP1). Rap y CAP presentaron una asociación independiente del nucleótido,pero dependiente de la isoprenilación de Rap1b. Aunque la fosforilación demostró modularnegativamente esta interacción, su efecto sobre la señal mitogénica mediada por Rap1 fuepositivo. CAP1, actuando como proteína andamio de Rap, resultó necesaria para la acción de Rap1, siendo requerida además para su activación y fosforilación, efecto que estaría mediado porla estimulación del aumento de los niveles de AMPc.
Activation of Rap1b by the exchange protein activated by cAMP (Epac) and its cAMPdependentprotein kinase (PKA)-mediated phosphorylation are required for cAMP dependentmitogenesis. However, the role of phosphorylation remains unknown. We assessed potential conformational changes induced by phosphorylation of Rap1busing the amide hydrogen/deuterium exchange mass spectroscopy (DXMS) and Crystallography. Exchange rates PKA-phosphorylated (Rap1-P) and phosphomimetic (Rap1-D) Rap1b proteinsshowed the same pattern of exchange, revealing an increased exchange rate in discrete regionsalong the protein, including a domain around the phosphorylation site and the effector domain. Crystal structure for the full length Rap1b-G12V-S179D showed that the presence of the S179Dinduce changes at the interface with switch I and II. Our second objective was finding Rap1b effectors modulated in a phospho-dependentfashion.. Within the clones isolated by Two Hybrid, we found the adenylate cyclase-associatedprotein 1 (CAP1). Rap/CAP association showed to be nucleotide independent, but dependent on Raps’ isoprenylation. Although, phosphorylation showed to negatively modulate this interaction,it had positive effect on the mitogenic signal mediated by Rap1. CAP, acting as a scaffoldingprotein for Rap1b, was necessary for Rap1 mediated action, and required for Rap1b activationand phosphorylation, effect mediated by stimulating the increase of the levels of cAMP.
Fil: Edreira, Martín Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.