Estudio de la estructura y regulación de la expresión de los genes Cab en plantas superiores

• Autores: Fernández, Sandra Viviana
• Año de publicación: 1996
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Staneloni, Roberto Julio
• Materia: PROTEINAS CAB; GENES LHCB1; EXPRESION ESPECIFICA DE ORGANO; PAPA (SOLANUM TUBEROSUM); FITOCROMO; CAB PROTEINS; LIGHT-HARVESTING CHLOROPHYLL A/B BINDING PROTEINS OF PHOTOSYSTEM II; LHCB1 GENES; POTATO (SOLANUM TUBEROSUM); PHYTOCHROME
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Se aislaron seis genes Lhc a partir de una biblioteca genómica de papa(Solanum tuberosum). Estos genes codifican polipéptidos que formarían parte de los complejos que captan la luz que luego es utilizada en la fotosíntesis. Estos genes se hallan en tandem y están separados por regiones de 1.3-1.4 kb. Todos poseen la misma orientación 5'( 3' y cada uno de ellos tiene su propio promotor localizado 5' río arriba de la región de código. Las proteínas deducidas a partir de las secuencias de bases, poseen todos los aminoácidos característicos de las proteínas CAB del PSII, Tipo I, las cuales están codificadas por los genes Lhcb1. Por lo tanto los genes aislados fueron denominados: Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 y Lhcb1*6. La región codificante de estos genes posee 798 pb excepto el Lhcb1*6 el cual fue aislado en forma incompleta (411 pb). Estos genes codifican proteínas de 265 aminoácidos, incluyendo el péptido señal. Los genes estudiados poseen un 94-98 por ciento de homología en sus secuencias de bases y codifican proteínas que poseen entre un 97.5 por ciento a 99.75 por ciento de identidad. Las regiones 5' flanqueantes de los seis genes poseen secuencias conservadas y que están presentes en otros genes cuya expresión es regulada por la luz (el fragmento de 62 pb localizado entre las cajas CAAT y TATA contiene tres secuencias GATA). La expresión de los genes Lhcb1 en las plantas de papa mostró ser específica de órgano. Diferentes transcriptos fueron detectados en las hojas de las plantas mientras que solo uno se detectó en los tallos y no hubo expresión en las raíces. Se determinó el sitio de iniciación de la transcripción para el gen Lhcb1*2. El mismo esta localizado a 69 nucleótidos río arriba del codón de iniciación de la traducción (codón ATG). Los resultados indicaron que la C en la secuencia CTTCAT constituye el primer nucleótido en el ARNm correspondiente al gen Lhcb1*2. La región localizada río arriba del gen Lhcb1*2 que se extiende hasta -1300pb fue secuenciada. Esta región contiene un motivo "G" (5'TGGTTGTGTC3') localizado entre las bases -162 a -171 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción. Recientemente fue demostrado que el factor citosólico GBF, el cual se une al motivo "G", se transloca al núcleo en presencia de luz, mientras que en la oscuridad permanece en el citoplasma (Harter et al, 1994). Las funciones regularais de la región 5' flanqueaste del gen Lhcb1*2 fueron analizadas en plantas transgénicas de tabaco. En la construcción realizada, la región promotora del gen Lhcb1*2 dirige la expresión del gen reportero uidA, el cual codifica la enzima (-glucuronidasa (GUS). El análisis de las plantas transgénicas reveló que la región 5' flanqueante (-1300 a +10) del gen Lhcb1*2 es suficiente para conferir una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo así como también una respuesta específica de órgano. Por otra parte, la expresión del gen uidA fue detectada en las plántulas transgénicas de tabaco a partir de las 72 hs luego de la germinación de las semillas. Este resultado se correlaciona con el tiempo de maduración de los cloroplastos (Oemüller et al,1986). Además, no se detectó expresión del gen uidA cuando las plántulas de tabaco transgénicas fueron cultivadas en presencia de un herbicida que impide el desarrollo de los cloroplastos. Por lo tanto, estos resultados indican que la presencia de cloroplastos maduros es necesaria para la expresión del GUS dirigida por el promotor del gen Lhcb1*2 aislado de plantas de papa. Se realizaron deleciones de la región promotora las cuales fueron fusionadas al gen uidA. De estos experimentos se pudo concluir que la región del promotor comprendida entre las bases -690 a +10 es suficiente para conferir una respuesta específica de órgano así como también una respuesta a la luz a través del fotoreceptor fitocromo.
A potato (Solanum tuberosum) genomic library was used to isolate five full-length genes and part of a sixth one, encoding the apoproteins of a light-harvesting complex (LHC). These genes are arrange in tandem with a spacing of 1.3-1.4 kb between neighboring genes. They present the same orientation and they have their own promoters 5'-upstream of the coding regions. All the Lhcb1 genes have 798 bp open reading frame coding for a protein of two hundred and sixty-five amino acids, including a transit peptide. The nucleotide homology among the five genes is between 94-98 per centum. The nucleotide sequences showed that they encoded very similar proteins (99.75 per centum o 97.50 per centum identities). The deduced amino acid sequences were homologous to the PSII Type I CAB proteins encoded by the Lhcb1 genes, so these genes were named Lhcb1*1, Lhcb1*2, Lhcb1*3, Lhcb1*4, Lhcb1*5 and Lhcb1*6, respectively. The 5'-flanking regions of the six potato genes shared conserved sequences already detected in other light-responsive genes (62 bp fragment located between the CAAT and TATA boxes containing three GATA motifs). The expression of Lhcb1 genes in potato was organ-specific. At least nine different transcripts can be recognized in leaves by the primer extension method. A unique transcript could be detected in stems and not in roots. The transcription start site for the Lhcb1*2 gene was determinated. It is located 69 nucleotides upstream from the ATG codon. Our results indicated that the C in the sequence CTTCAT would be the first nucleotide in the Lhcb1*2 mRNA. The 5' upstream region of Lhcb1*2 extending from -1300 bp to the cap site was sequenced. This region contained a G-box motif (TGGTTGTGTC) located between -162 and -171 from the transcription start site. It has been recently demonstrated that the translocation of the cytosolic GBFs (G-box binding factor) to the nucleus is light-regulated (Harter et al, 1994). The regulatory function of the 5'-flanking region of the potato Lhcb1*2 was analyzed in transgenic tobacco plants. The construct used contained the uidA gene which was under the control of the potato Lhcb1*2 promoter. Analysis of transgenic plants revealed that the 5'-flanking region (-1300 to +10, relative to the transcription start site) of the Lhcb1*2 gene is sufficient to confer a phytochrome response as well as organ-specific expression. In ours experiments, the expression of the uidA gene was detected in the transgenic tobacco seedlings around 72 h after germination. This result correlates well with the time of maturation of the chloroplasts (Oemüller et al, 1986). Furthermore, the expression of uidA was not detected when transgenic seedlings were grown in presence of Norflurazon. These results correlates the presence of mature chloroplasts with the GUS expression directs by the Lhcb1*2 promoter. We have obtained constructs in which the uidA gene was under the control of deletions of the 5'-flanking region of potato Lhcb1*2. The -690 to +10 flanking region of the Lhcb1*2 is enough to confer organ-specific and phytochrome-regulated expression on the uidA coding sequence.
Fil: Fernández, Sandra Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.