Glicosilación de proteínas y control de calidad del plegamiento

• Autores: Movsichoff, Federico
• Año de publicación: 2007
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Parodi, Armando José
• Materia: N-GLICOSILACION; ERAD; MANOSIDASA; SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE; TRYPANOSOMA CRUZI; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; OLIGOSACARILTRANSFERASA; STT3; N-GLYCOSYLATION; ERAD; MANNOSIDASE; SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE; TRYPANOSOMA CRUZI; SACCHAROMYCES CEREVISIAE; OLIGOSACCHARYLTRANSFERASE; STT3
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La N-glicosilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más frecuentes en células eucariotas y consiste en la transferencia en bloc de un oligosacárido de un derivado lipídico, dolicol, a una cadena polipeptídica naciente, reacción que es catalizada por una enzima oligomérica, la oligosacariltransferasa (OST). Dependiendo de la glicoproteína esta modificación puede ser esencial para la adquisición de la estructura terciaria en el lumen del retículo endoplásmico (RE), para el control de calidad del plegamiento en esa organela, para la la correcta localización de las proteínas lisosomales o para los diversos roles que tienen las glicoproteínas en la membrana plasmática o en el medio extracelular. En la primera parte de esta tesis estudiamos el rol del N-glicano en la degradación de glicoproteínas mal plegadas asociada al RE. Se ha propuesto que la formación del isómero B de Man8GlcNAc2 (M8B) por la α-manosidasa I del RE constituye una señal para enviar a las glicoproteínas que se encuentran irremediablemente mal plegadas al proteasoma para su degradación. Contrariamente a lo informado en la literatura, pudimos detectar in vivo, pero no in vitro, una actividad muy débil de α-manosidasa en Schizosaccharomyces pombe. La enzima degrada a Man9GlcNAc2 dando M8B y es inhibida por kifunensina. Las células de S. pombe poseen una capacidad muy limitada de demanosilar el Man9GlcNAc2 presente en glicoproteínas mal plegadas, incluso luego de una larga estadía en el RE. A su vez, no se detectó una degradación preferencial de las glicoproteínas que contenían M8B. Sin embargo, la disrupción del gen que codifica a la α-manosidasa impidió casi por completo la degradación de una glicoproteína mal plegada. Este trabajo, junto con otros resultados cognitivos publicados anteriormente, pueden ser explicados asumiendo que el rol de la α-manosidasa del RE en la degradación de glicoproteínas es independiente de su actividad enzimática. De esta forma, la enzima se comportaría como una lectina que uniría oligosacáridos de polimanosa de diversas estructuras y pertenecería, junto con sus homólogos Htm1p/Mnl1p/EDEM, a una cadena de transporte responsable de enviar a las glicoproteínas irremediablemente mal plegadas a los proteasomas. La kifunensina y el 1-deoximanojirimicina, al ser análogos de manosa, se comportarían como inhibidores de la actividad de lectina de la manosidasa del RE y/o de Htm1p/Mnl1p/EDEM. En la segunda parte de esta tesis estudiamos la especificidad de la OST con respecto al oligosacárido dador. La mayoría de los eucariotas muestran una marcada preferencia para la transferencia tanto in vivo como in vitro del mayor oligosacárido unido a dolicol-P-P (Glc3Man9GlcNAc2) a las proteínas nacientes frente a los intermediarios biosintéticos que carecen de los tres residuos de glucosa. La OST es un complejo multimérico formado por ocho subunidades, una de las cuales, la Stt3p, es la subunidad catalítica. Los tripanosomátidos carecen del complejo multimérico de la OST y expresan en cambio solo esta última proteína. Contrariamente a la OST de la mayoría de las células eucariotas, la Stt3p de estos parásitos transere Man7−9GlcNAc2 y Glc1−3Man9GlcNAc2 a la misma velocidad en ensayos libres de células. Reemplazamos la Stt3p de Saccharomyces cerevisiae por su homólogo de Trypanosoma cruzi y encontramos que el complejo de la OST que se forma transfiere preferentemente el oligosacárido triglucosilado tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, la preferencia por Glc3Man9GlcNAc2 es una característica determinada por el complejo y no por la subunidad catalítica. Los resultados incluidos en la presente tesis dieron lugar a las siguientes publicaciones: Preferential transfer of the complete glycan is determined by the oligosaccharyltransferase complex and not by the catalytic subunit. Castro O., Movsicho F. and Parodi A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(40): 14756-60, 2006. Characterization of Schizosaccharomyces pombe ERα -Mannosidase: A Reevaluation of the Role of the Enzyme on ER-associated Degradation. Movsicho F., Castro O.A. and Parodi A.J. Mol. Biol. Cell, 16(10): 4714-4724, 2005.
Glycosylation of asparagine residues is one of the main posttranslational modifications in eukaryotic cells. It involves the en bloc transfer of a lipid linked oligosaccharide to a nascent polypeptide catalyzed by a multimeric enzyme called oligosaccharyltransferase (OST). Depending on the specific glycoprotein, this modification may be essential for the acquisition of the tertiary structure within the endoplasmic reticulum (ER) lumen, for the quality control of folding in the same subcellular location, for the correct sorting of lysosomal enzymes, or for the many roles that glycoproteins have either in the plasma membrane or in the external milieu. In the rst part of this thesis we studied the role of the N-glycans in the ER-associated degradation of misfolded glycoproteins. It has been postulated that creation of Man8GlcNAc2 isomer B (M8B) by ER- α-mannosidase I constitutes a signal for driving irreparably misfolded glycoproteins to proteasomal degradation. Contrary to a previous report, we were able to detect in vivo (but not in vitro) an extremely feeble ER α-mannosidase activity in Schizosaccharomyces pombe. The enzyme yielded M8B on degradation of Man9GlcNAc2 and was inhibited by kifunensin. Live S. pombe cells showed an extremely limited capacity to demannosylate Man9GlcNAc2 present in misfolded glycoproteins even after a long residence in the ER. In addition, no preferential degradation of M8B-bearing species was detected.Nevertheless, disruption of the α-mannosidase encoding gene almost totally prevented degradation of a misfolded glycoprotein. This and other conflicting reports may be best explained by assuming that the role of ER mannosidase on glycoprotein degradation is independent of its enzymatic activity. The enzyme, behaving as a lectin binding polymannose glycans of varied structures, would belong together with its enzymatically inactive homologue Htm1p/Mnl1p/EDEM, to a transport chain responsible for delivering irreparably misfolded glycoproteins to proteasomes. Kifunensin and 1-deoxymannojirimycin, being mannose homologues, would behave as inhibitors of the ER mannosidase or/and Htm1p/Mnl1p/EDEM putative lectin properties. In the second part of this thesis we studied the donor oligosaccharide specicity for the OST. Most eukaryotic cells show a strong preference for the transfer in vivo and in vitro of the largest dolichol-P-P-linked glycan (Glc3Man9GlcNAc2) to protein chains over that of biosynthetic intermediates that lack the full complement of glucose units. The oligosaccharyltransferase (OST) is a multimeric complex containing eight different proteins, one of which (Stt3p) is the catalytic subunit. Trypanosomatid protozoa lack an OST complex and express only this last protein. Contrary to the OST complex from most eukaryotic cells, the Stt3p subunit of these parasites transfers in cell-free assays glycans with Man7−9GlcNAc2 and Glc1−3Man9GlcNAc2 compositions at the same rate. We have replaced Saccharomyces cerevisiae Stt3p by the Trypanosoma cruzi homologue and found that the complex that is formed preferentially transfers the complete glycan both in vivo and in vitro. Thus, preference for Glc3Man9GlcNAc2 is a feature that is determined by the complex and not by the catalytic subunit. The results included in this thesis led to the following articles: Preferential transfer of the complete glycan is determined by the oligosaccharyltransferase complex and not by the catalytic subunit. Castro O., Movsicho F. and Parodi A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(40): 14756-60, 2006. Characterization of Schizosaccharomyces pombe ER α-Mannosidase: A Reevaluation of the Role of the Enzyme on ER-associated Degradation. Movsicho F., Castro O.A. and Parodi A.J. Mol. Biol. Cell, 16(10): 4714-4724, 2005.
Fil: Movsichoff, Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.