Síntesis de conjugados de oligosacáridos antigénicos de Trypanosoma cruzi orientados al diagnóstico

• Autores: López, Laura Rosana
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Marino, María Carla; Giorgi, María Eugenia
• Materia: TRYPANOSOMA CRUZI; ENFERMEDAD DE CHAGAS; α-GAL; NEOGLICOCONJUGADOS; ELISA; TRYPANOSOMA CRUZI; CHAGAS DISEASE; α-GAL; NEOGLYCOCONJUGATES; ELISA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, la parasitosis humana de mayor prevalencia en América Latina, para la cual no existen drogas o vacunas apropiadas. El diagnóstico rutinario de esta enfermedad se basa en la detección de anticuerpos contra T. cruzi mediante técnicas serológicas convencionales que presentan limitaciones en cuanto a su reproducibilidad, sensibilidad y especificidad. Por este motivo, el desarrollo de nuevas herramientas y/o estrategias para la optimización del diagnóstico de la infección por T. cruzi, es de gran interés. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico para la enfermedad de Chagas, basadas en conjugados de unidades antigénicas peptídicas y sacarídicas. Los neoglicoconjugados contendrían, por un lado, el epítopo α-Gal (α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-GlcNAc), que es la estructura antigénica mínima encontrada en las mucinas de tripomastigote de T. cruzi, u oligosacáridos estructuralmente relacionados. Por otro lado, incluirían un péptido antigénico, con una estructura basada en proteínas asociadas a mucinas de superficie del parásito, en estadíos del mamífero. El propósito de esto es incrementar la respuesta de ciertos antígenos proteicos, utilizados actualmente como reactivos para el serodiagnóstico de la enfermedad de Chagas, de forma tal de generar reactivos serológicos mixtos conteniendo simultáneamente ambos epítopos. Esta conjugación podría mejorar la inmunodiagnosis. En primera instancia se sintetizó el disacárido antigénico α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp, que es reconocido por los anticuerpos líticos anti α-galactosilo que se desarrollan en sueros de pacientes chagásicos crónicos. La estrategia sintética desarrollada para este derivado fue posteriormente aplicada a la síntesis del epítopo α-Gal. En base a nuestro interés en estudiar la interrelación entre la transialidación catalizada por trans-sialidasa de T. cruzi, enzima característica del parásito y la inmunogenicidad, se sintetizó el trisacárido α-D-Galp-(1→3)-[β-D-Galp-(1→6)]-β-D-Galp, que contiene tanto la unidad antigénica α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp como una β-D-Galp terminal aceptora de ácido siálico en la reacción de transialidación. Por otro lado, se sintetizó el trisacárido α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp, análogo de α-Gal con una unidad de Glc en reemplazo de la unidad de GlcNAc. Si bien este trisacárido no se encuentra en las mucinas de tripomastigotes, presenta una reactividad frente a anticuerpos anti α-Gal de sueros de pacientes chagásicos similar al trisacárido antigénico natural α-Gal, y su síntesis es más sencilla. Para α-Gal se estudiaron diferentes alternativas en varias etapas de la síntesis, tendientes a solucionar problemas relacionados con la baja reactividad de donores y aceptores derivados de GlcNAc. Todos los oligosacáridos se funcionalizaron con el brazo espaciador 6-aminohexilo para luego conjugarlos con BSA ó con péptidos antigénicos diseñados especialmente, mediante el método del escuarato de dialquilo, obteniéndose así los neoglicoconjugados. Estos se ensayaron contra anticuerpos anti α-Gal purificados y sueros de pacientes chagásicos crónicos por técnica de ELISA indirecto.
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas disease, the most prevalent human parasitosis in Latin America, for which no vaccines or appropriate drugs are available. The routine diagnosis of this disease is based on the detection of antibodies against T. cruzi using conventional serological techniques that present limitations in terms of their reproducibility, sensitivity and specificity. Therefore, the development of new tools and/or strategies for optimization of diagnosis of T. cruzi infection is of great interest. In this thesis work we plan to develop and evaluate new diagnostic tools for Chagas disease, based on neoglycoconjugates containing on the one hand the epitope α-Gal (α-Galp-(1→3)-β-Galp-(1→4)-GlcNAc), which is the minimum antigenic structure found in the mucins of T. cruzi trypomastigote or analogues, and on the other one, an antigenic peptide, whose structure is based on parasite mucin-associated surface proteins, in mammal stages. The purpose of this is to improve the response of certain protein antigens, currently used as reagents for the serodiagnosis of Chagas disease, with the aim of generating mixed serological reagents containing both epitopes simultaneously. This conjugation could improve the immunodiagnosis. First, the antigenic disaccharide α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp was synthesized, which is recognized by lytic anti-α-galactosyl antibodies developed in sera from chronic chagasic patients. The synthetic strategy used for this derivative was subsequently applied to the synthesis of the α-Gal epitope. Based on our interest in studying the interrelation between the transialidation catalyzed by the trans-sialidase of T. cruzi, an enzyme characteristic of the parasite, and the immunogenicity, the trisaccharide α-D-Galp-(1→3)-[β-D-Galp-(1→6)]-D-Galp was synthesized, which contains both, the antigenic unit α-D-Galp-(1→3)-D-Galp and a terminal β-D-Galp unit as sialic acid acceptor in the trans-sialidase reaction. On the other hand, the trisaccharide α-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp analog of α-Gal was synthesized, with a glucose unit instead of that of GlcNAc. Although this trisaccharide is not found in trypomastigote mucins, its reactivity against anti-α-Gal antibodies in sera from chagasic patients is comparable to the natural antigenic α-Gal trisaccharide and it is simpler to synthesize. For the synthesis of α-Gal, different alternatives aimed at solving problems related to the low reactivity of GlcNAc derivatives as donor or acceptor were analyzed. All the oligosaccharides were functionalized with the 6-aminohexyl spacer and then conjugated with BSA or specially designed antigenic peptides, by the dialkyl squarate method, obtaining the neoglycoconjugates. These were tested against purified antibodies anti α-Gal and sera from chagasic patients by indirect ELISA techniques.
Fil: López, Laura Rosana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.