Glicosilfosfatidilinositoles : su rol en transducción de señales en células de mamífero : estudio de su estructura

• Autores: Vaena, Silvia Graciela
• Año de publicación: 1999
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Vila, María del Carmen; Muchnik de Lederkremer, Rosa María
• Materia: GLICOSLILFOSFATIDILINOSITOL; INOSITOLFOSFOGLICANO; FOSFATIDILINOSITOL; FOSFOLIPASA C; FOSFOLIPASA D; ACTH; AMPC; CORTICOSTERONA; ALDOSTERONA; S. POMBE; GLYCOSYLPHOSPHATIDYLINOSITOL; INOSITOLPHOSPHOGLYCAN; PHOSPHATIDYLINOSITOL; PHOSPHOLIPASE C; PHOSPHOLIPASE D; ACTH; CAMP; CORTICOSTERONE; ALDOSTERONE; SIGNALING
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los glicosilfosfatidilinositoles (GPIs) son una familia de compuestos que pueden actuar como anclas de proteínas a membranas celulares y también pueden estar libres en estas membranas. Por hidrólisis de GPI con fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC)se libera inositolfosfoglicano (IPG) que ha sido propuesto como segundo mensajero de insulina y otras hormonas. Resultados del laboratorio mostraron que ACTH es capaz de hidrolizar GPI y que un IPG con estructura conservada purificado de Trypanosoma cruzi es capaz de inhibir la acumulación de aldosterona mediada por ACTH en células adrenocorticales de vaca. El objetivo de este trabajo fue estudiar: a) GPIs presentes en corteza adrenal bovina, b) La participación de estos compuestos en la respuesta de ACTH y c) GPI y sus precursores en Schizosaccharomycespombe, un sistema no estudiado hasta el presente, con el fin de buscar una fuente de GPI para los estudios biológicos. En este trabajo se mostró la presencia de anclas de GPI en cortezaadrenal pues se encontraron compuestos suceptibles a ácido nitroso y sepurificó parcialmente una enzima anclada por GPI la fosfatasa alcalina, FAL, cuyo ancla fue utilizada como fuente de IPG y se probó su efecto inhibitorio sobre la respuesta de ACTH. Con respecto a la participación de GPI en la respuesta de ACTH,se encontró que esta hormona es capaz de activar una PI-PLC, a través de una proteína G inhibible por toxina de pertussis, Gi/o, en células adrenocorticales, lo que muestra que el receptor de ACTH puede acoplarse a más de un tipo de proteína G (Gs, Gi). La activación de PI-PLCpor la hormona sugiere la producción de IPG. Se encontró que un IPG purificado de T. cruzi, fue capaz de inhibir en células adrenocorticales la producción de aldosterona, corticosterona (en rata) ycortisol (en vaca). ACTH utiliza AMPc como segundo mensajero. Losresultados sugieren que el efecto inhibitoriode IPG estaría mediado poruna activación de fosfodiesterasa, enzima que degrada AMPc, y unainhibición de PKA. Se sabe que IPG es liberado al medio extracelular y luego entra enla célula donde actúa. En concordancia con este hecho hemos visto que: a) los sobrenadantes de células tratadas con ACTH son capaces deinhibir la respuesta de la hormona y b) el agregado del anticuerpo anti-CRDcontra IPG aumenta la acumulación de esteroides mediada por ACTH. Estos resultados muestran que ACTH es capaz de liberar IPG elcual inhibe su respuesta y reafirman la hipótesis de que el IPG participa en la respuesta fisiológica de esta hormona. Por otro lado, con el objeto de obtener una fuente de GPI para realizar los estudios biológicos, más fácil de trabajar que el trypanosoma, se estudiaron GPI y sus precursores, los inositolfosfolípidos, en S. pombe, pues se ha encontrado que en otra levadura, Saccharomyces cerevisiae, estas anclas son abundantes. S.cervisiae es la única levadura cuyos GPIs han sido estudiados hasta el momento por lo cual fue interesante encarar el estudio de otra levadura, Schizosaccharomyces pombe de caracteristicas biológicas diferentes a S.cervisiae. Se ha visto que los inositolfosfolípidos consisten principalmente enfosfatidilinositol y no contienen alquilglicerol ni ceramida. Se ha obtenido la estructura completa de estos inositolfosfolípidos por estudios en TLC, RPTLC y CGL, a partir de cultivos con o sin incorporaciones de palmiticoradioactivo. Se encontró un único ácido graso esterificando la posición 2 de fosfatidilinositol y una mezcla en posición 1. A pesar de que no se incorporó ceramida en inositolfosfoceramidas, se demostró la existencia de [³H]-esfingomielina, esfingo fosfolípido característico de mamíferos, conteniendo ceramida radioactiva. Se detectó una banda de proteínas de PM 19.000 aproximadamente que incorpora [³H]-ácido palmítico. Luego de digestión con proteasa e hidrólisis con GPI-PLD se liberaron lípidos marcados que prueban la existencia de anclas en esta fracción. Por otra parte, se evidenció la presencia de GPIs libres en extractos orgánicos por susceptibilidad a ácido nitroso y PIPLC. Estos compuestos, fueron utilizados como fuentes de IPG y se probó su efecto inhibitorio sobre la acumulación de corticosterona por ACTH.
Glycosylphosphatidylinositols (GPIs) are best known as membraneanchors found on many eukaryote plasma membrane proteins rangingfrom protozoal to mammalian molecules. The hydrolysis of GPI byphosphatidyl-inositol phospholipase C (PI-PLC) releases an inositolphosphoglycan (IPG) which has been proposed to mediate the action ofdifferent hormones. Previous studies from our group demonstrated that ACTH was ableto induce hydrolysis of GPI and that the IPG derived from T.cruzi inhibited ACTH-mediated accumulation of aldosterone in bovine adrenocorticalcells. In this study we have investigated: a) the presence of GPI in bovineadrenal cortex, b) the involvement of this compound in ACTH signaling c)the presence of GPI and its precursors in Schizosaccharomyces pombe inorder to obtain a GPI source for biological studies. Compounds sensitive to nitrous acid treatment were found inadrenal cortex which proved the presence of GPI in this system. Anenzyme anchored by GPI, alkaline phosphatase, was partially purifiedfrom this tissue and was used as a source for IPG. This IPG was able toinhibit ACTH-mediated steroid accumulation. It was found that ACTH activates PI-PLC through a pertussis toxinsensitive G protein, Gi/o, in adrenocortical cells. This indicates that the ACTH receptor can activate different G proteins (Gs, Gi). PI-PLCactivation would release IPG. An IPG of chemically defined structure obtained from T. cruzi wasshown to inhibit ACTH-stimulated aldosterone and corticosteroneproduction in rat adrenocortical cells as well as cortisol accumulation inbovine adrenocortical cells, suggesting that IPG signaling could be aconserved mechanism in mammalian ACTH action.cAMP is the second messenger in ACTH response. In agreement, IPG inhibition of ACTH action was found to be a consequence of aphosphodiesterase activation and protein kinase A inhibition. It is known that IPG is released to the extracellular medium andthen re-enters the cell by an energy-dependent mechanism. Accordingly,we found that: a) the supernatants from ACTH-treated cells were able toinhibit the stimulation of corticosterone production by the hormone; b) theaddition of IPG antibodies (anti-CRD) to adrenocortical cells increased ACTH-response. These results demonstrate that ACTH stimulates IPGrelease which in turn inhibits adrenal steroids production by the hormone. In order to obtain GPI for signaling experiments from an enrichedsource different from Trypanosoma cruzi, GPI and related lipids from afission yeast, S. pombe, were studied. At present, S. cerevisiae is the onlyyeast where GPI structures have been determined and seem to beabundant. It was interesting to study these compounds from anotheryeast, S. pombe, which differs from S. cerevisiae in several biologicalfeatures.lnositolphosphoceramide was found to be the main usphingolipid in S. cerevisiae. In contrast, diacylglycerol containing inositol phospholipidshave been identified as the unique inositolphospholipids (IPLs) in S.pombe extracts and the complete structure of these compounds havebeen determined by TLC, RPTLC and GLC from [³H]-palmitic acid labeledor non-labeled cultures. A unique fatty acid esterified the sn-2 position of IPLs. In contrast, different fatty acids were found in the sn-1 position ofthese compounds. Sphingomielin, a sphingophospholipid characteristic ofmammalian cells, containing [³H]-palmitic acid-labeled ceramide wasdetected. A GPI-anchored protein of 19 kDa has been found by [³H]palmiticacid metabolic labeling. Evidence for free GPIs was shown bynitrous acid release of inositol phospholipids from sugar containing lipids. IPGs obtained from these GPIs by PI-PLC treatment proved to inhibit ACTH action.
Fil: Vaena, Silvia Graciela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.