Rol de la neddilación en el desarrollo neuronal temprano

• Autores: Becerra Contreras, Raquel Yudith
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Refojo, Damián; Stefani, Fernando
• Materia: MODIFICACION POSTRADUCCIONAL; CITOESQUELETO; ACTINA; COFILINA; BEDD8; DESARROLLO NEURONAL TEMPRANO; POSTTRANSLATIONAL MODIFICATION; CYTOSKELETON; ACTIN; COFILIN; NEDD8; EARLY NEURONAL DEVELOPMENT
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Nedd8 es la proteína con mayor homología a Ub y se conjuga covalentemente a las proteínas blanco a través de residuos de lisina mediante una cascada de reacciones enzimáticas llamada neddilación. La función de la neddilación ha sido relacionada a la regulación de la proliferación celular a través de la conjugación de Nedd8 a una familia de E3 ligasas llamada culinas. A pesar de ser una vía activa en sistema nervioso central, su función y blancos moleculares específicos ha sido poco explorado. El objetivo de este trabajo fue caracterizar la función de la neddilación en el desarrollo neuronal e identificar los blancos celulares y sus mecanismos moleculares de acción. Para abordar el rol de la neddilación durante el desarrollo neuronal, empleamos distintas técnicas de experimentación, que van desde cultivo y transfección de células, electroporación inutero, y espectrometría de masa, hasta microscopía confocal, súper-resolución y live-imaging. Bloqueando la neddilación mediante herramientas genéticas o farmacológicas durante las primeras etapas de desarrollo neuronal, se produjo una fuerte reducción del crecimiento axonal y dendrítico. Dicha reducción fue parcialmente recuperada tratando las neuronas con compuestos que alteran la dinámica del citoesqueleto, quedando en evidencia que la neddilación afecta la dinámica de proteínas citoesqueletales durante el desarrollo. Para determinar la existencia de otros blancos moleculares diferentes de culinas que puedan mediar los efectos observados en neuronas, se procedió a identificar los blancos específicos de la neddilación, y luego de un minucioso y sistemático trabajo de screening por espectrometría de masa fueron encontradas cientos de proteínas nediladas de las cuáles la Cofilina fue especialmente relevante dentro del grupo de proteínas asociadas al citoesqueleto por su función en la regulación de la polimerización de actina. Luego de validar la Cofilina como verdadero blanco de Nedd8 y el residuo de lisina donde ocurre la modificación, se demostró que la inhibición de la neddilación de Cofilina incrementa su actividad de corte de microfilamentos de actina. Dentro de las consecuencias neuronales al inhibir la neddilación de Cofilina se observó una disminución del crecimiento dendrítico y axonal y una menor complejidad dendrítica, así como también un aumento en el número de espinas dendríticas en neuronas en cultivo. Los resultados del trabajo indican que más allá de las culinas hay cientos de proteínas que también son neddiladas, y durante el desarrollo neuronal temprano la neddilación cumple un rol fundamental regulando la dinámica del citoesqueleto mediante la neddilación de Cofilina.
Nedd8 is the protein with the highest homology to ubiquitin and it conjugates covalently to target proteins through lysine residues via a cascade of enzymatic reactions called Neddylation. The function of neddylation has been related to the regulation of cellular proliferation trough the Nedd8 conjugation to a family of E3 ligases called cullins. Despite being an active path in the central nervous system, its function and specific molecular targets has been poorly explored. The aim of this work was to characterize the function of neddylation in neuronal development and to identify the cellular targets and the molecular mechanisms of action. To address the role of neddylation during neuronal development, we employed different experimental techniques, going from cell culture and transfection, in-utero electroporation, and mass spectrometry, to confocal, super-resolution and live-imaging microscopy. Blocking neddylation using genetic or pharmacological tools during early neuronal development, resulted in a strongly reduced axonal and dendritic growth. This reduced growth was reverted treating the neurons with compounds that altered cytoskeletal dynamics, suggesting that neddylation affects the dynamics of cytoskeletal proteins during neuronal development. To assess the existence of other molecular targets different from cullins that underlie the effects observed in neurons, we performed a meticulous and systematic screening by mass spectrometry. As a result, hundreds of neddylated proteins were found. Among them, cofilin was especially relevant within the cytoskeletal associated protein group by its function regulating actin polymerization. After validating cofilin as bonafide neddylated target and the lysine residue where the modification occurs, we demonstrated that inhibition of cofilin neddylation increases its capacity to sever microfilaments. Regarding the neuronal consequences to inhibit cofilin neddylation, we observed a decreased dendritic and axonal growth and dendritic branching in cultured neurons and in and in-vivo system, as well as an increase in dendritic spines number in cultured neurons. The results of this work indicated that beyond cullins there are hundreds of proteins that are also neddilated and during early neuronal development the neddylation has a fundamental role regulating the cytoskeleton dynamic thought cofilin neddylation.
Fil: Becerra Contreras, Raquel Yudith. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.