La descondensación de la cromatina de espermatozoides de mamíferos : estudio de su mecanismo molecular y su posible utilidad como bioindicador del efecto de disruptores endócrinos...

• Autores: Sánchez, Melisa Celeste
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Calvo, Juan Carlos; Fontana, Vanina Andrea
• Materia: DESCONDENSACION DE LA CROMATINA ESPERMATICA; HEPARAN SULFATO; HEPARINA; DERMATAN SULFATO; ESPERMATOZOIDE; ENDOSULFAN; ETANOL; SPERM CHROMATIN DECONDENSATION; HEPARAN SULFATE; HEPARIN; DERMATAN SULFATE; SPERMATOZOA; ENDOSULFAN; ETHANOL
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetadaprincipalmente por protaminas en lugar de histonas. Las cisteínas presentes en las protaminas formanpuentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad yresistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta elsitio de fecundación. Luego que el espermatozoide penetra el oocito es imprescindible que se produzcala descondensación de su cromatina para que se reemplacen las protaminas espermáticas por histonasoocitarias. La descondensación de la cromatina involucra dos eventos: se deben reducir los puentesdisulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesosserían el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) oocitarios. Cuando este proceso decondensación de la cromatina, que ocurre durante la espermatogénesis para mantener la integridad delespermatozoide, se ve afectado por diversas causas, puede resultar en fallas de la descondensación quese evidencian una vez que el oocito es penetrado. Por otro lado, es sabido que la exposición a tóxicosambientales puede provocar efectos deletéreos sobre la calidad de los espermatozoides y la fertilidadmasculina. Las técnicas de reproducción asistida han podido resolver problemas de motilidad, defectosespermáticos, concentración de gametas muy reducida en el fluido seminal (oligozoospermia) perotodavía no pueden solucionar los defectos de la descondensación del núcleo espermático dentro deloocito. Esto pone en evidencia la importancia del proceso de descondensación, que no puede serreemplazado por las técnicas de reproducción asistida, y permite pensar en utilizarlo como un posibleindicador del efecto de disruptores endocrinos, tanto in vivo como in vitro. Los objetivos de esta tesisfueron (1) avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina deespermatozoides, así como también en su (2) rol como posible bioindicador de efectos deletéreoscausados por tóxicos ambientales o ingeridos, tales como el alcohol y el plaguicida endosulfán. Enprimer lugar, fue posible caracterizar el sistema de descondensación in vitro en el modelo de ratón alcoincubar los espermatozoides con distintos glicosaminoglicanos y GSH, determinándose de estamanera las moléculas candidatas a ser posibles agentes descondensantes, las concentraciones y tiemposóptimos de incubación. Como consecuencia de esto, fue posible detectar un efecto sinérgico existenteentre la heparina (utilizada como equivalente molecular del heparán sulfato) y el dermatán sulfato, losúnicos glicosaminoglicanos estudiados con potencial capacidad descondensante. El efecto de estos dosglicosaminoglicanos también fue evaluado mediante la técnica de microscopia electrónica detransmisión, la cual puso en evidencia los cambios sufridos por los espermatozoides durante el procesode descondensación. Una vez caracterizado el sistema, se logró evidenciar el aumento de ladescondensación in vitro que ocurre cuando se incuban los espermatozoides con endosulfán o etanol,como también luego de la ingesta de etanol. Además, fue posible evaluar el efecto del plaguicida sobrela fragmentación del ADN, así como también si existe alguna correlación entre la misma y ladescondensación de la cromatina. Los efectos del etanol observados in vitro fueron confirmados enexperimentos in vivo, en los cuales se intoxicaron ratones macho para realizar experimentos defecundación in vitro. Estos son los primeros resultados obtenidos descondensando in vitro en presenciade heparina y GSH, espermatozoides previamente incubados con endosulfán o etanol, que ponen demanifiesto que este ensayo podría utilizarse como centinela para evaluar posibles efectos de tóxicosambientales o ingeridos.
In contrast to somatic cells, sperm has its DNA packed mainly by protamines rather thanhistones. The presence of cystein in protamines allows for the formation of intra andinterchain disulfide bonds, giving great stability and resistance to the sperm nucleus, enablingit to travel through the male and female reproductive tracts and reach the site of fertilizationwith its DNA intact. An essential step, once the sperm enters the oocyte, is the decondensationof its chromatin by replacing sperm protamines by oocyte histones. Chromatin decondensationinvolves two events: disulfide bridges should be reduced (thio-reduction) and the protaminesremoved. The molecules involved in these processes in vivo would be reduced Glutathione (GSH) and heparan sulfate (HS) present in the oocyte. When this process of chromatincondensation, which occurs during spermatogenesis to maintain the integrity of sperm, isaffected by various causes, decondensation failure may result following oocyte penetration atfertilization. It is also well known that exposure to a toxic environment can cause deletereouseffects on sperm quality and male fertility. Assisted reproduction techniques have beensuccessful in solving problems of motility, various sperm defects, very low concentration ofgametes in seminal fluid (oligozoospermy) but still cannot solve the shortcomings of thedecondensation of the sperm nucleus within the oocyte. This highlights the importance of thedecondensation process, which cannot be replaced by assisted reproduction techniques andled us to think of its possible use as a bioindicator of the effect of endocrine disruptors, both invivo and in vitro. The objectives of this thesis were (1) to advance in the study of themechanism of sperm chromatin decondensation as well as (2) its role as a possible bioindicatorof environmental toxicity caused by toxic agents, such as alcohol and the pesticide endosulfán. First, it was possible to characterize the process of decondensation in vitro in the mouse byincubating sperm with different glycosaminoglycans and GSH, which led us to identifymolecules which could behave as putative decondensing agents, concentrations and optimalincubation times. Subsequently, it was possible to detect a synergistic effect between heparin (as a substitute for heparan sulfate) and dermatan sulfate, the only glycosaminoglycansstudied with potential to decondense the sperm nucleus in vitro. The effect of these twoglycosaminoglycans was also evaluated on sperm morphology and ultrastructure throughtransmission electron microscopy, which allowed us to visualize the changes suffered by spermduring the decondensation process. Once the system was characterized, we were able todemonstrate the increase in in vitro decondensation that occurs when sperm are incubatedwith endosulfán or ethanol, as well as after ethanol ingestion. In addition, it was possible toassess the effect of this pesticide on DNA fragmentation as well as its possible correlation tochromatin decondensation. The alcohol effects observed in vitro were confirmed with in vivoexperiments in which male mice were intoxicated and their sperm subsequently used toperform in vitro fertilization. These are, to our knowledge, the first results obtaineddecondensing in vitro in the presence of heparin and GSH, sperm previously incubated withendosulfán or ethanol, suggesting that the sperm decondensation assay could be used assentinel to evaluate possible effects of environmental or ingested toxic agents.
Fil: Sánchez, Melisa Celeste. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.