Identificación y caracterización funcional de genes candidatos asociados a la senescencia foliar en girasol basado en perfiles transcripcionales y metabólicos

• Autores: Moschen, Sebastián
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Heinz, Ruth A.; Fernández, Paula
• Materia: GIRASOL; SENESCENCIA; GENES CANDIDATO; TRANSCRIPTOMICA; METABOLOMICA; BIOLOGIA DE SISTEMAS; SUNFLOWER; SENESCENCE; CANDIDATE GENES; TRANSCRIPTOMICS; METABOLOMICS; SYSTEMS BIOLOGY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico queinterviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visualesresultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución dela senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así comotambién la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia engirasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico,transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia engirasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescenciatanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuestafrente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas deldesarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila,azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliarverde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediantelas cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, encondiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojasde girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primariosincluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual secuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso desenescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerandotanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuenciasputativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo,como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz deoligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico delos datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. Deeste modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloquesde genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato seprofundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes delas cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintasestrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando unaaproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron losprogramas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueronadaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron unacorrespondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes nivelesanalizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudoobservar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos yaminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2-EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles decorrelación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución delproceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmentefactores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados afuturo sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas demejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestropaís. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven laadopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.
Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, eitherfrom genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. Insunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescenceprocess has an economic impact involved in the gap between potential and realyield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area forlonger periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolutionof leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leafnecrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process insunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic,transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using asystems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated toleaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlledconditions. Response to water restrictions imposed at different plant developmentstages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performedthrough different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leafnitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception ofradiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescenceprocess progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metaboliteextraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection ofapproximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organicacids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leadingto the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates,phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate genestrategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported assenescence associated in model species, as well as through a concerted expressionanalysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the completesignificant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluatedconditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regressionmodels. In this way, different functional categories were identified for gene clusterswith similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate geneswas deepened by searching into the senescence associated gene databases for modelspecies, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathwaysleading to senescence in sunflower among the transcription factor domains genedatabase. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate theinformation from the different physiological, metabolomic and transcriptomicstrategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence insunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflowerdata. These results showed a correspondence between the changes detected by thedifferent strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosyntheticactivity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotidesand amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recyclingprocesses showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels andhigher levels of correlation and co-expression making them important candidatesbiomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanismsinvolved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as wellas to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genescould be further validated on breeding materials to be incorporated into assistedbreeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore,the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis,contribute to the crop development and promote the adoption of genomics andpost-genomics in the different stages of sunflower breeding.
Fil: Moschen, Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.