Identificación y caracterización funcional de genes candidatos asociados a la senescencia foliar en girasol basado en perfiles transcripcionales y metabólicos - Moschen, Sebastián (2014)
El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico queinterviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visualesresultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución dela senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así comotambién la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia engirasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico,transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia engirasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescenciatanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuestafrente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas deldesarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila,azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliarverde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediantelas cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, encondiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojasde girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primariosincluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual secuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso desenescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerandotanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuenciasputativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo,como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz deoligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico delos datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. Deeste modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloquesde genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato seprofundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes delas cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintasestrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando unaaproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron losprogramas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueronadaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron unacorrespondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes nivelesanalizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudoobservar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos yaminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2-EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles decorrelación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución delproceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmentefactores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados afuturo sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas demejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestropaís. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven laadopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.