Estudios sobre la terapia fotodinámica a partir de ALA en células leucémicas sensibles y resistentes a drogas de quimioterapia

• Autores: Diez, Berenice Andrea
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fukuda, Haydée; Hajos, Silvia
• Materia: TERAPIA FOTODINAMICA; ACIDO 5-AMINOLEVULICO; LEUCEMIA; RESISTENCIA A DROGAS; TERAPIAS COMBINADAS; PHOTODYNAMIC THERAPY; 5-AMINOLEVULINIC ACID; LEUKEMIA; DRUG RESISTANCE; COMBINED THERAPIES
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La Terapia Fotodinámica (TFD) es utilizada para el tratamiento del cáncer y otras patologías no malignas. Se basa en la administración un compuesto fotosensibilizante (FS) que se acumula selectivamente en el tejido maligno y al recibir fotones interactúa con el O2 produciendo especies reactivas del oxígeno (ROS), que son altamente tóxicas y desencadenan la muerte celular. La administración exógena del ácido 5-aminolevúlico (ALA), precursor biológico de la síntesis de los tetrapirroles, induce la acumulación de protoporfirina IX (PpIX), un FS muy eficiente. La quimioterapia administrada en altas dosis, seguida del transplante autólogo de médula ósea es una de las modalidades terapéuticas más utilizadas para el tratamiento de la leucemia. Sin embargo, una pequeña proporción de células leucémicas indiferenciadas que se encuentran en un estado quiescente, pueden resultar resistentes a la quimioterapia y ser reinsertadas en el paciente luego del transplante. Por este motivo actualmente se estudian métodos de purgado potencialmente efectivos para eliminar a las células malignas remanentes. Además, el uso de quimioterapia presenta otras limitaciones como el desarrollo de fenotipos celulares resistentes a drogas y efectos secundarios no deseados. En esta tesis hemos estudiado los efectos de la TFD basada en ALA (TFD-ALA) en tres líneas celulares leucémicas murinas, LBR-, sensible a drogas de quimioterapia, LBR-D160 y LBR-V160, resistentes a doxorubicina (DOX) y vincristina (DOX), respectivamente. Para ello evaluamos la síntesis y acumulación de PpIX sintetizada a partir de ALA, y observamos que en las tres líneas estudiadas esta síntesis aumentó en función de la concentración y del tiempo de incubación con ALA. Estudios de microscopía confocal indicaron que las mitocondrias son el principal sitio de localización de PpIX. Mediante estudios de viabilidad celular demostramos la eficacia de la TFD-ALA en las tres líneas celulares, indicando la falta de resistencia cruzada en el caso de las líneas resistentes a drogas de quimioterapia. Por otra parte estudiamos los mecanismos involucrados en la muerte celular producida por la TFD, donde observamos un aumento en los parámetros de estrés oxidativo como la despolarización de la membrana mitocondrial, la producción de oxígeno singulete y de anión superóxido, indicando la importancia de las mitocondrias en los efectos de la TFD. El análisis de parámetros tanto morfológicos como bioquímicos demostró la predominancia de apoptosis como principal mecanismo de muerte, en particular a través de la vía intrínseca, lo que concuerda con el rol activo de las mitocondrias previamente mencionado. Evaluamos además los efectos al combinar la TFD-ALA con los agentes antineoplásicos DOX y VCR, en un modelo in vitro in vivo, utilizando la línea LBR-. En ambos casos observamos un beneficio significativo al utilizar las terapias combinadas, evidenciando la ventaja de esta modalidad frente a las terapias utilizadas en forma independiente. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran el beneficio potencial de utilizar la TFD-ALA como método de purgado de la médula ósea de pacientes con leucemia, especialmente para eliminar fenotipos resistentes a drogas. Además, los estudios utilizando las terapias combinadas indican la posibilidad de disminuir las dosis de drogas de quimioterapia, minimizando así las limitaciones ocasionadas por este tratamiento.
Photodynamic therapy (PDT) is a cancer treatment modality which involves the administration of a given photosensitizing agent (PS), its preferential accumulation in malignant tissue and the subsequent activation by light of appropriate wavelength. Interaction between the excited PS and molecular oxygen produces singlet oxygen as well as other reactive oxygen species (ROS) selectively destroying the target cells. Exogenous administration of 5-aminolevulinic acid (ALA) induces the accumulation of protoporphyrin IX (PpIX), a highly photosensitive compound. Autologous bone marrow transplantation (ABMT) after high dose chemotherapy is a widely accepted therapeutic modality for the management of hematologic malignancies. The major disadvantage of this approach is the possible contamination of the autograft with remaining leukemic cells which leads to recurrence of the disease. Besides, the use of chemotherapy agents promotes the development of drug resistant phenotypes and produces serious side adverse effects in many patients. In this work we studied the effects of ALA-based PDT (ALA-PDT) in three leukemic murine cell lines: LBR-, drug sensitive, LBR-D160 resistant to doxorubicin (DOX) and LBR-V160, resistant to vincristine (VCR). The synthesis and accumulation of PpIX after ALA administration was evaluated, which increased with the concentration and incubation time with ALA. Confocal microscopy studies revealed that PpIX was mainly localized in mitochondria. Cell viability studies demonstrated that ALA-PDT was effective in the three cell lines, indicating the lack of cross-resistance in LBR-D160 and LBR-V160 cells. The mechanisms involved in the death caused by ALA-PDT were also studied. It was observed an increase in oxidative stress parameters, such as mitochondrial membrane depolarization, singlet oxygen and superoxide anion production. Morphological and biochemical studies showed that apoptosis, especially involving intrinsic pathway, was the main death mechanism induced by ALA-PDT. We also evaluated on the LBR- cell line the effects of ALA-PDT combined with DOX or VCR using an in vitro-in vivo model, and a significant benefit for combination therapies, with respect to each one independently, was found. The results obtained in this work show that ALA-PDT could be useful as a purging method during ABMT in leukemia patients, especially to eliminate drug resistant cells. Besides, the use of combined therapies allows the possibility of reducing the doses of chemotherapeutic agents, thus minimizing the limitations of this therapy.
Fil: Diez, Berenice Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.