Desarrollo de dispositivos de microfluídica para un nuevo enfoque en la producción de anticuerpos monoclonales

• Autores: Karp, Paola Julieta
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Helguera, Gustavo Fernando; Lerner, Betiana
• Materia: DISPOSITIVO DE MICROFLUIDICA; ANTICUERPO MONOCLONAL RECOMBINANTE; CELULAS ADHERENTES; ANALISIS DE IMAGENES; CRECIMIENTO CELULAR; MICROFLUIDIC DEVICE; RECOMBINANT MONOCLONAL ANTIBODY; ADHERENT CELLS; IMAGE ANALYSIS; CELL GROWTH
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La presente tesis está centrada en el diseño y fabricación de dispositivos miniaturizados escalables que permiten optimizar las condiciones de cultivo y crecimiento de células adherentes de mamífero, para favorecer una mayor producción de proteínas recombinantes en condiciones controladas. Primero, se diseñaron y fabricaron distintas versiones de dispositivos de microfluídica de pequeño volumen (DMPV; 32,22 μl) de polidimetilsiloxano (PDMS) con vidrio u otros materiales para el cultivo de células CHO-K1 y HEK-293T. El modelado computacional del flujo del medio de cultivo en el DMPV arrojo velocidades adecuadas para el crecimiento celular, permitiendo cultivar células por más de 2 meses. En este DMPV se cultivaron las líneas celulares adherentes CHO-ahIFNα2b y HEK- ahIFNα2b que expresan un anticuerpo monoclonal (mAb) recombinante anti hIFN-α2b que está siendo evaluado para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico. La productividad de ambas líneas celulares fue mayor en los DMPV en comparación con la obtenida utilizando el método de cultivo celular adherente tradicional. Además, el análisis funcional de los mAbs producidos en los DMPVs no mostró diferencias significativas en comparación con los mAbs producidos con el método tradicional. También se desarrolló un software de procesamiento y análisis de imágenes basado en Python para el crecimiento celular (PIACG, por sus siglas en ingles), que permite calcular el área total ocupada por las células en las cámaras de los DMPV en respuesta a diferentes concentraciones de suero fetal bovino, a partir de imágenes de microscopía. Por último, se diseñó y fabricó un dispositivo de microfluídica de gran volumen (DMGV, 2,8 ml) para el cultivo de células CHO-ahIFNα2b. El crecimiento celular con bombeo activo del flujo en el DMGV se mantuvo constante a lo largo del cultivo. En este DMGV se cuantificaron los niveles de glucosa y lactato del medio de cultivo y se observó que sus concentraciones se mantuvieron sin cambios significativos durante todo el estudio. Por último, es interesante observar que los mAbs producidos en el DMGV exhiben una mejora significativa en su afinidad y actividad biológica, en comparación con los producidos con el método tradicional de cultivo. Estos resultados sugieren que los DMPV permiten cultivar células adherentes de mamífero por más de 60 días y líneas celulares que expresan mAbs recombinantes. También se desarrolló un software que permite monitorear el crecimiento celular en estos DMPV. Finalmente, se demostró que los DMPV son escalables más de 80 veces su volumen, manteniendo estables parámetros críticos de cultivo como glucosa y lactato durante el cultivo.
The present thesis is focused on the design and manufacture of scalable miniaturized devices that allow optimizing the culture and growth conditions of adherent mammalian cells, to favor a greater production of recombinant proteins under controlled conditions. First, different versions of small volume microfluidic devices (SVMD; 32,22 μl) of polydimethylsiloxane (PDMS) were designed and manufactured with glass or other materials for the culture of CHO- K1 and HEK-293T cells. The computational modeling of the flow of the culture medium in SVMD yielded adequate velocities for cell growth, allowing cells to be cultured for more than 2 months. Adherent cell lines CHO-ahIFNα2b and HEK-ahIFNα2b expressing a recombinant monoclonal anti-hIFN-α2b antibody (mAb) that is being evaluated for the treatment of systemic lupus erythematosus were cultured in this SVMD. The productivity of both cell lines was higher in SVMD compared to that obtained using the traditional adherent cell culture method. Furthermore, the functional analysis of the mAbs produced in the SVMDs did not show significant differences compared to the mAbs produced with the traditional method. Python-based image analysis and processing software for cell growth (PIACG) was also developed, which allows calculating the total area occupied by cells in the SVMD chambers in response to different concentrations of fetal bovine serum, from bright-field microscopy images. Finally, a large volume microfluidic device (LVMD, 2,8 mL) was designed and manufactured for the cultivation of CHO-ahIFNα2b cells. Cell growth with active pump flow cycles in LVMD remained constant throughout the culture. In this LVMD, the levels of glucose and lactate of the culture medium were quantified and it was observed that their concentrations remained without significant changes throughout the study. Finally, it is interesting to note that the mAbs produced in the DMGV exhibit a significant improvement in their affinity and biological activity, compared to those produced with the traditional culture method. These results suggest that these SVMDs allow culturing adherent mammalian cells for more than 60 days and cell lines expressing recombinant mAbs. Software was also developed to monitor cell growth in SVMDs. Finally, it was shown that SVMD are scalable more than 80 times, maintaining stable critical culture parameters such as glucose and lactate during culture.
Fil: Karp, Paola Julieta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.