Estudio de la participación de la melatonina en la fisiología de la retina de Hámster Dorado

• Autores: Faillace, María Paula
• Año de publicación: 1996
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Rosenstein, Ruth Estela; Cardinali, Daniel Pedro
• Materia: RETINA; HAMSTER DORADO; MELATONINA; REGULACION FOTICA; ROL FISIOLOGICO; RETINA; MELATONIN; GOLDEN HAMSTER; PHOTIC REGULATION; PHYSIOLOGICAL ROLE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La melatonina caracterizada originalmente en la glándula pineal fue más tarde identificada en la retina de diversas especies, así como las enzimas involucradas en su síntesis, la serotonina-N-acetiltransferasa (NAT) y la hidroxiindol-O-metiltransferasa (HIOMT). El hámster dorado ha sido considerado frecuentemente el modelo clásico para el estudio de la melatonina pineal, sin embargo, la melatonina retiniana en esta especie ha recibido relativamente poca atención. El objetivo de este trabajo de tesis consistió en examinar la biosíntesis del metoxiindol en la retina del hámster, así como elucidar algunos de los mecanismos involucrados en la regulación de su síntesis y su posible rol fisiológico a nivel local. En este sentido, se describe por primera vez la presencia de un ritmo en el contenido retiniano de melatonina en el hámster dorado, con valores máximos en la segunda mitad de la noche. La síntesis de melatonina en la retina del hámster es independiente de la actividad pineal. Asimismo, se demuestra la capacidad de las retinas aisladas de sintetizar melatonina. La síntesis de melatonina es regulada directamente por la señal fótica ambiental, sin indicación de la existencia de un ritmo de naturaleza endógena en los experimentos realizados en este trabajo. El GABA, postulado como un neurotransmisor retiniano regulatorio de procesos asociados a oscuridad, estimula la producción in vitro de melatonina retiniana, probablemente a través de receptores de tipo A, en tanto que antagonistas específicos del receptor GABAA suprimen el incremento in vitro de melatonina en oscuridad. El "turnover" de GABA es máximo en la fase de oscuridad y precede al aumento en el contenido de melatonina. En conjunto, estas evidencias sugieren que el GABA actúa como intermediario entre la señal de oscuridad y la inducción de la síntesis del metoxiindol. El AMPc ha sido postulado como la señal intracelular involucrada en la inducción génica de la NAT retiniana. La existencia de una correlación temporal entre el ritmo en el contenido de AMPc y el de melatonina (ambos regulados de manera análoga por la señal fótica ambiental) avala resultados previos. Sin embargo, en este trabajo se postula adicionalmente que el GMPc participa en la regulación de la síntesis de melatonina retiniana, tanto por sus efectos in vitro, como por la correlación temporal entre las variaciones diarias de ambas moléculas. Considerando que el GABA estimula la acumulación de GMPc, pero inhibe la de AMPc, se sugiere que el efecto gabaérgico sobre la síntesis de melatonina podría estar mediado por el incremento en los niveles de GMPc retinianos. Por otra parte, se demuestra que la melatonina estimula la producción de GMPc, a través de una acción dual sobre la síntesis y degradación, ambos efectos tendientes al incremento en los niveles del nucleótido cíclico. La activación de la enzima de síntesis, así como la inhibición de la enzima de degradación podrían ocurrir a través de la disminución de los niveles de calcio citoplasmático. En este sentido, la melatonina inhibe en forma inmediata (luego de 10 seg) la captación de 45Ca2+ en fracciones sinaptosomales crudas. La melatonina incrementa la captación de 3H-glutamato, a través de un mecanismo independiente del calcio extracelular, así como la liberación de 3H glutamato, por un mecanismo dependiente del catión. La exposición más prolongada a melatonina (durante 20 min) estimula la captación de 45Ca2+ por fracciones crudas sinaptosomales. Considerando que análogos permeables del GMPc provocan efectos similares a los de la melatonina sobre estos parámetros, el metoxiindol podría actuar a través del incremento en el contenido del nucleótido. En este trabajo de tesis, se describe también la presencia de receptores específicos, de alta afinidad, con un perfil farmacológico compatible con el descripto para receptores de melatonina de tipo ML-1. Los resultados sugieren además que estos receptores podrían estar acoplados con una proteína G inhibitoria. De este modo, la melatonina disminuye significativamente los niveles retinianos de AMPc, quien a su vez podría actuar como un segundo mensajero del metoxiindol y/o regular negativamente su propia síntesis. En todos los casos, los efectos de la melatonina fueron dependientes del horario, mostrando una alta correlación con la variación diaria en la concentración de receptores al metoxiindol. La densidad máxima se observó a la medianoche, coincidiendo con el horario de máxima sensibilidad. La variación diaria en la concentración de sitios receptores podría deberse a mecanismos de "up y down-regulation" inducidos por el ligando endógeno. En conjunto, los resultados obtenidos permiten postular la participación de la melatonina retiniana en los mecanismos de transducción y procesado de la información fótica como una señal "senso-parácrina", es decir una molécula sintetizada y liberada por los fotorreceptores en respuesta a un estímulo sensorial (la oscuridad) y que actúa localmente modulando diversos aspectos de la fisiología retiniana.
Melatonin was initially characterized in the pineal gland and later identified in the retina of several species, along with its synthesizing enzymes serotonin N-acetyltransferase (NAT) and hydroxyindole-O-methyltransferase (HIOMT).% Although the Golden hamster is one of the most widely used models in the investigation of pineal melatonin physiology, retinal melatonin in this species has received relatively little attention. The aim of this work was to examine the biosynthesis of melatonin in the hamster retina, as well as to elucidate the mechanisms involved in the regulation of its synthesis. Additionally, some aspects of the physiological role of retinal melatonin were tudied. A daily rhythm in hamster retinal melatonin levels, which peaks late in the night, as well as the ability of the hamster retina to regulate melatonin synthesis in isolated conditions, were found. Melatonin synthesis was independent on pineal activity. and was directly regulated by photic stimuli. In fact, a circadian rhythm was absent in the ex vivo experiments performed under free running conditions. GABA, a retinal transmitter that mediates dark-related processes, stimulated melatonin synthesis in vitro, probably acting through a GABAA receptor.% Moreover, the dark-induced increase in melatonin production was blocked by a specific GABAA antagonist receptor (bicuculline). Retinal GABA turnover was maximal at night and preceded the increase of melatonin levels by about 4 hours. These results indicate that GABA could be the intercellular message linking darkness with melatonin biosynthesis. Cyclic AMP has been postulated as the intracellular messenger involved in the genomic induction of retinal NAT. A temporal correlation between melatonin and cAMP content (mainly influenced by the photic stimulus), which supports previous studies, was observed. A significant increase of melatonin synthesis stimulated by cGMP analogs, and a temporal relationship between rhythms in cGMP levels and melatonin content were also described. Considering that GABA stimulates cGMP and decreases cAMP accumulation, GABA effects on melatonin synthesis could be mediated by an increase in cGMP levels. A dual effect of melatonin on cGMP biosynthesis was described, i.e. by increasing its synthesis and by inhibiting its degradation, both resulting in an increase of cGMP levels. This effect could occur by rapid (about 10 sec) melatonin inhibition of calcium uptake, since calcium could inhibit retinal guanylate cyclase and stimulate retinal phosphodiesterase activities. Melatonin significantly increased 3H-glutamate uptake, this effect persisting in a Ca2+-free medium. On the other hand, melatonin increased 3H-glutamate release through an effect that was Ca2+ sensitive. Melatonin significantly increased 45Ca2+ uptake by a crude synaptosomal retinal fraction, after a 20 min incubation. Taking into account that melatonin affects the cGMP system and that 3H-glutamate uptake and release and 45Ca2+ uptake were stimulated by cGMP analogs, these results suggest that melatonin could increase 3H-glutamate release by increasing cGMP levels. The presence of specific high-affinity receptors, showing a pharmacological profile consistent with a ML-1-like site, was also demonstrated. In addition, an equipotent decrease in the total specific binding of 2-[125I]-melatonin caused by GTP and GDP suggested that these binding sites could be G inhibitory protein-coupled receptors. Likewise, melatonin significantly decreased cAMP accumulation. This cyclic nucleotide might act as a second messenger for melatonin action, and/or regulate melatonin biosynthesis by a negative feed-back mechanism. In all cases, melatonin effects occurred in a time-dependent manner, showing a high correlation with daily variations in 2-[125I]-melatonin specific binding sites density found in hamster retina. Maximal density was observed at 24.00 h in coincidence with the maximal sensitivity window for the melatonin effects. Daily variations in the density of melatonin binding sites is probably regulated through up- and down-regulation mechanisms, induced by melatonin on its own binding sites. Collectively, the foregoing results suggest that in the hamster retina, melatonin could participate in the photic information transduction or processing mechanisms, as a "sensory-paracrine" signal. In fact, melatonin is released by photoreceptor cells in response to a sensorial stimulus (darkness), and acts locally by modulating several aspects of retinal physiology.
Fil: Faillace, María Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.