Regulación de la expresión génica de la delta-aminolevulinato sintetasa por cAMP y glucosa : participación de las quinasas de proteínas A y C

• Autores: Varone, Cecilia Laura
• Año de publicación: 1998
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Cánepa, Eduardo Tomás
• Materia: DELTA-AMINOLEVULINATO SINTETASA; HEPATOCITOS; FENOBARBITAL; HEMO; EXPRESION GENICA; CAMP; QUINASA DE PROTEINAS DEPENDIENTE DE CAMP; GLUCOSA; ESTERES DE FORBOL; QUINASA DE PROTEINAS C; DELTA-AMINOLEVULINATE SYNTHASE; GENE EXPRESSION; HEPATOCTYTES; CAMP; PHENOBARBITAL; HEME; CAMP DEPENDANT PROTEIN KINASE; GLUCOSE; PHORBOL ESTERS; PROTEIN KINASE C
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El primer paso en la biosíntesis del hemo en las células animales es catalizado por laenzima mitocondrial δ-aminolevulinato sintetasa (ALA-S), que condensa glicina ysuccinil CoA para formar ácido 6-aminolevulínico y que, al menos en hígado, es lalimitante de la velocidad. En hígado esta enzima constitutiva regula la producción dehemo necesario para sintetizar las proteínas citocromos P-450. Aunque en los tejidos animales el nivel de enzima es muy bajo, la transcripción delgen de ALA-S en hígado de animales de experimentación aumenta cuando se lesadministran compuestos porfirinogénicos como el fenobarbital. Diferentes mecanismosfueron propuestos por los que el hemo puede regular la expresión de ALA-S a niveltranscripcional reprimiendo la sintesis del RNA, a nivel postranscipcional disminuyendola estabilidad del mensajero y a nivel postraduccional inhibiendo la entrada de la enzimaa la mitocondria. En el presente trabajo examinamos el mecanismo ejercido por cAMP y glucosa sobrela expresión génica de ALA-S en hepatocitos de ratas normales y con diabetesexperimental, y en cultivos de células HepG2. Se ha demostrado que el cAMP potenciala inducción mediada por fenobarbital, aumentando la cantidad del mRNA de ALA-S através de la activación de la quinasa de proteínas dependiente de cAMP. El efectoinductor ejercido por el fenobarbital es mayor en hepatocitos diabéticos que en normalesdebido probablemente al nivel de cAMP elevado que presentan. Por otro lado, se hademostrado que la glucosa inhibe la inducción de la expresión de ALA-S mediada porfenobarbital en hepatocitos normales pero no en diabéticos. Este efecto glucosa esrevertido por la presencia de dibutiril CAMP,de activadores de la adenilil ciclasa o de uninhibidor de fosfodiesterasa. Se presentan evidencias que los efectos del cAMP y laglucosa son ejercidos a nivel transcripcional. La vida media del mRNA de ALA-S no semodifica en presencia de ellos. Mas aún, los efectos de cAMP y la glucosa semanifiestan en el análisis de tranfecciones transientes de células HepG2 con un vectorque contenie la región promotora del gen ALA-S clonada en 5’ del gen de lacloramfenicol acetiltransferasa. En este tipo de experimentos hemos confirmado ademásque el efecto de cAMP requiere la activación de la proteina quinasa dependiente decAMP ya que hemos obtenido resultados similares cotransfectando con la subunidad Cde la PKA. Finalmente se demuestra que la activación de la PKC actúa negativamentesobre el mRNA de ALA-S, probablemente a nivel transcripcional, de acuerdo a lasdeterminaciones por Northern, slot blot y análisis de transfecciones transientes de células HepG2. Asimismo se observa que el efecto del éster de forbol TPA anula el efectoinductor del cAMP. Es posible que ambos caminos de transducción de señales, queinvolucran la activación de PKA y PKC, estén interconectados en la regulación de laexpresión génica de ALA-S.
The first step of heme biosynthesis pathway in animal cells is catalyzed by themitochrondrial enzyme δ-aminolevulinate synthase (ALA-S), wich condensates glycineand succinyl-CoA to form δ-aminolevulinic acid, and -at least in liver- is ratecontrolling. ln liver, this housekeeping enzyme regulates the supply of heme necessaryto form respiratory cytochrome P-450 proteins. Although the enzyme level in animal tissues is usually very low, the transcriptionalrate of ALA-S gene is greatly increased in experimental animal livers after theadministration of a variety of porphyrinogenic effectors such as phenobarbital. Differentmechanisms have been proposed to show that heme can regulate ALA-S geneexpression at the transcriptional level by repressing mRNA biosynthesis, at the posttranscriptionallevel by diminishing ALA-S mRNA stability, and at the post-traductionallevel by inhibiting the enzyme entrance to the mitochondria. In the present work we examined the mechanisms underlying the effect of cAMP andglucose on ALA-S synthase gene expression both in isolated hepatocytes from normaland experimental diabetic rats, and in HepG2 cells. It was demonstrated that cAMP potentiates phenobarbital-mediated induction,increasing the amount of ALA-S mRNA by means of the activation of cAMP dependentprotein kinase. The inducing effect exerted by the phenobarbital is greater in diabetichepatocytes than in normal cells, due probably to the high level of endogenous cAMP indiabetic cells. One the other hand, it was shown that glucose inhibits phenobarbitalinduced ALA-S expression in normal hepatocytes, but not in diabetic ones. This glucoseeffect can be prevented adding dibutyril cAMP, adenylate cyclase activators, or aphosphodiesterase inhibitor. There are evidences that both cAMP and glucose effects would operate at thetranscriptional level. ALA-S mRNA half life was not modified in their presence. Moreover cAMP and glucose effects were manifested in transfection analysis of HepG2cells using ALA-S promoter region cloned 5’ upstream chloramphenicolacetyltransferase reporter gene. With this kind of experiments we were also able toconfirm that the effect of cAMP requires the activation of cAMP dependent proteinkinase, since it was possible to bypass this activation cotransfecting with PKA subunit C. Finally there are evidences that protein kinase C activation influences negatively ALA-S mRNA -probably at the transcriptional level-, according to Northern, slot blotand transient transfection analysis of HepG2 cells. We could also observe that the effectof phorbol ester TPA overcomes dibutyril cAMP induction. Thus, it is feasible that bothsignal transduction pathways involving PKA and PKC activation are interconnected inthe regulation of ALA-S gene expression.
Fil: Varone, Cecilia Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.