Dos nuevos genes de Beauveria bassiana : Una quitonasa y una proteína de transporte que podrían estar relacionados con la patogenicidad

• Autores: Berretta, Marcelo Facundo
• Año de publicación: 2001
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Grau, Oscar
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La búsqueda de genes relacionados con la patogenicidad de Beauveriabassiana, se llevó a cabo siguiendo la estrategia de estudiar la expresión de una cepavirulenta del hongo, cultivada in vitro, en condiciones nutricionales similares a lasque este patógeno se encuentra sometido durante la penetración del hospedante. Paraello se utilizó como única fuente orgánica de crecimiento, una preparación de lacutícula del insecto Diatraea saccharalis, el sustrato natural cuya degradación esrequerida para el establecimiento de la infección. Se aplicó la técnica de Differentialdisplay para la detección de genes que se expresaran en forma diferencial bajo estacondición. Por comparación entre los productos de amplificación de ADNc,obtenidos por RT-PCR del ARN extraído del hongo cultivado con cutícula, o sinella, se detectaron fragmentos únicamente presentes en el primer caso. Los patronesde bandas se obtuvieron utilizando un primer oligo-dT, en combinación condecámeros de secuencia arbitraria. Se desarrolló una metodologia que consistió en lamarcación de los productos de PCR con grupos fluorescentes, y su análisis en unsistema de secuenciación automática. Los fragmentos amplificados diferencialmentefueron utilizados como sondas, para estudiar el nivel de expresión de los transcriptoscorrespondientes, por la técnica de northern. Paralelamente, se determinó el númerode copias de los genes respectivos, en el genoma de B. bassiana, mediante la técnicade southern. Se construyó una genoteca de ADN genómico de B. bassiana en unvector de sustitución derivado del fago λ. El screening de la misma con una sondade expresión diferencial, permitió identificar un gen que codifica para una proteínadeducida de 495 aminoácidos. La secuencia de la misma, presentó homología conuna familia de proteínas de transporte a través de membrana, de especificidadesdiversas. Adyacente a dicho gen, en posición aguas arriba de la secuencia genómica,se identificó otro gen de copia única y de expresión concertada con el anterior, quecodifica para la enzima quitosanasa. Con la secuencia del ADNc se comprobó laexistencia de dos intrones en la estructura primaria del gen. La proteína deducida, de 232 aminoácidos, presenta 74% de identidad de secuencia con la misma enzima deotro hongo entomopatógeno, Metarhizium anisopliae. Otras tres secuencias fúngicascompletan el grupo de quitosanasas eucariotas conocidas, separado de las enzimasde origen bacteriano, por análisis de agrupamiento en base a similitud de secuencia. Se propone la participación de esta enzima en la degradación de la cutícula de losinsectos, por parte de los hongos entomopatógenos.
A virulent strain of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana wascultured in vitro under nutritional conditions resembling those encountered by thepathogen during penetration of the host. This strategy was followed to study theexpression of fungal genes related to pathogenicity. The fungus was grown with thecuticle of the insect Diatraea saccharalis as the sole source of carbon and nitrogen. The degradation of this substrate is needed for the infection to be accomplished. The Differential display technique was used to detect genes that were differentiallyexpressed under this culture condition. The cDNA amplification products obtainedby RT-PCR of the mRNA extracted from the fungus cultured with, or withoutcuticle, were compared. By this means, fragments only present in the formercondition, were detected. The banding patterns were obtained by using an oligo-dTprimer in combination with 10-mer primers of arbitrary sequence. Original protocolswere developed to perform the analysis on an automated DNA sequencer, throughthe incorporation of fluorescent labels in the PCR products. The differentiallyamplified fragments were used as probes to study the expression level of thecorresponding genes by northern. The southern technique was used to estimate thecopy number of the genes within the genome. A λ derived cloning vector wasemployeed in the construction of a genomic library of the fungus. The screening ofthis library with a differential probe allowed for the detection of a gene encoding aprotein of 495 amino acids. The deduced sequence of this protein shows similarity tomembers of a family of membrane transporters with diverse specificities. Anothergene is located immediately upstream. This one was also found to be overexpressedin culture on cuticle. It encodes the enzyme chitosanase. The cDNA sequenceevidenced the existence of two introns in the primary structure of the gen. Thededuced protein has 232 amino acids, and it shows 74% identity with the sameenzyme of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. The other threechitosanase genes from eukaryotic origin, which are known to date, belong to fungi. They cluster together and remain separate from the bacteria] proteins, when theirsequences are compared. The enzyme produced by entomopathogenic fungal speciesis a good candidate to participate in the degradation of the insect cuticle
Fil: Berretta, Marcelo Facundo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.